姬阿美，白春麗，葉 倩，周 燕*，劉旭平,2*，譚文松,2，劉志亮

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237；2. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；

3.山東信得動物疫苗有限公司，山東 諸城 262204）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由ND 病毒（NDV）感染所引起的一種禽類急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。該傳染病分布于世界各地，致死率極高，被國際獸醫(yī)局定為A 類烈性傳染病[1-2]，是目前危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。

接種疫苗是防控ND 最有效的策略。但采用傳統(tǒng)的雞胚工藝生產(chǎn)ND 疫苗，存在操作復(fù)雜、生產(chǎn)效率低、規(guī)模放大受限、SPF 級雞胚來源有限以及雞胚殘體處理困難等缺點[3]。而以動物細(xì)胞作為病毒增殖的基質(zhì)生產(chǎn)疫苗，具有生產(chǎn)工藝易于放大、生產(chǎn)周期短、疫苗純度高、穩(wěn)定性好、抗原特性更接近自然株等優(yōu)勢[4]。近年來，一些原代細(xì)胞和細(xì)胞系已用于NDV 的增殖，包括雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、雞胚肝臟（CEL）細(xì)胞、DF-1（源自CEF）細(xì)胞、非洲綠猴腎（Vero）細(xì)胞和乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）[5-10]。但原代細(xì)胞生命周期有限，經(jīng)數(shù)次傳代后逐漸衰老，需要重新獲取。此外，這些細(xì)胞貼壁生長的特點，不但影響生產(chǎn)過程的規(guī)?；?，而且培養(yǎng)過程常需添加5%～10%血清。由于血清成分復(fù)雜，含多種雜蛋白，可能攜帶病毒及支原體等污染源，導(dǎo)致生產(chǎn)過程不穩(wěn)定，進(jìn)而影響疫苗產(chǎn)品質(zhì)量。因此，建立基于無血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)ND 疫苗是未來該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢。

工藝參數(shù)的合適與否會影響細(xì)胞的生長、病毒的產(chǎn)量以及生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性。因此，參數(shù)優(yōu)化是病毒生產(chǎn)工藝建立過程中重要的環(huán)節(jié)。董炳梅等通過優(yōu)化NDV 在貼壁BHK-21 細(xì)胞中的增殖條件，從而建立NDV Lasota 株的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝，HA 效價達(dá)8 log2HAU/25 μL[9]。Shittu 等將懸浮培養(yǎng)的SciPC 細(xì)胞（源自雞胚胎）應(yīng)用于NDV 增殖，并探究了細(xì)胞接種密度、不同維持培養(yǎng)基對病毒產(chǎn)量的影響，最終獲得1.02×108EID50/mL 的高病毒效價[11]。在利用PBG.PK2.1 細(xì)胞擴增甲型流感病毒的研究中，Gr?nicher等對MOI 和胰蛋白酶濃度優(yōu)化，并通過分批補料補充病毒生產(chǎn)期間的營養(yǎng)，使病毒HA 效價提高至3.24 log10HAU/100 μL[12]。

目前，ND 疫苗的生產(chǎn)在很大程度上依賴于雞胚，主要因為基于細(xì)胞生產(chǎn)病毒的工藝不成熟且病毒產(chǎn)量低。為了提高病毒產(chǎn)量，本研究在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)BHK-21 細(xì)胞來生產(chǎn)NDV，通過單克隆細(xì)胞株的篩選、病毒在細(xì)胞中的傳代適應(yīng)以及工藝參數(shù)（MOI、TPCK-胰酶用量、稀釋比例）的優(yōu)化，以建立基于BHK-21細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)體系中的NDV生產(chǎn)工藝，為ND細(xì)胞苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞 雞胚適應(yīng)的NDV LaSota 株，TCID50值為8.0 log10TCID50/mL，由山東信得動物疫苗有限公司提供。將其在細(xì)胞中傳代，以獲得適應(yīng)細(xì)胞的NDV 后用于后續(xù)實驗。懸浮培養(yǎng)的BHK-21 單克隆株（BHK-v002、BHK-v015、BHK-v011）及貼壁BHK-21 細(xì)胞由本研究室保存。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自上海倍諳基生物科技有限公司；SF201 培養(yǎng)基為本研究室自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基；胎牛血清（FBS）購自Biosun；0.25%（w/v）胰蛋白酶、TPCK-胰酶及臺盼藍(lán)均購自美國Sigma 公司；IC1000 自動細(xì)胞計數(shù)儀（Counter star）購自上海睿鈺生物科技有限公司。

1.3 BHK-21 單克隆細(xì)胞株的篩選 將3 株處于對數(shù)生長期的BHK-21 單克隆細(xì)胞（BHK-v002、BHKv015、BHK-v011）以6.0×106個/mL 的活細(xì)胞密度（VCD）離心全換液接種至125 mL 搖瓶中，工作體積為30 mL（下同）。分別按0.1%、0.5%、1.0%的體積比接種雞胚適應(yīng)的NDV（8.0 log10TCID50/mL），并添加5 μg/mL TPCK-胰酶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中的搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，培養(yǎng)96 h。每24 h 取樣，檢測VCD[13]及HA 效價[14]。其中VCD 通過臺盼藍(lán)染色法采用IC1000 自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行檢測。

1.4 BHK-v002 細(xì)胞的培養(yǎng) BHK-v002 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基SF201 中的懸浮批培養(yǎng)，即將BHK-v002細(xì)胞以0.8×106個/mL～1.0×106個/mL 的VCD 稀釋接種至搖瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取樣檢測VCD 和活率（Viability），直至細(xì)胞活率降至50%以下，結(jié)束培養(yǎng)。活率的檢測方法同VCD。

1.5 細(xì)胞適應(yīng)的NDV 的制備及病毒效價的測定結(jié)果 將1.3 篩選出來的處于對數(shù)生長期的BHK-v002細(xì)胞以4.0×106個/mL 的VCD 離心全換液接種至搖瓶中，按0.01%體積比接種雞胚適應(yīng)的NDV（8.0 log10TCID50/mL），并添加5 μg/mL TPCK-胰酶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每24 h 取樣，檢測細(xì)胞VCD 和病毒TCID50效價[15]。接毒后48 h（Hours post infection，hpi）收集的病毒液作為第一代（P1），將該病毒液以同樣條件接種至細(xì)胞中，收集本輪48 hpi 病毒液作為第二代（P2），如此連續(xù)傳5～6 代，根據(jù)每代檢測結(jié)果確定病毒在細(xì)胞中傳代所得最高TCID50效價，并重復(fù)該代次以制備大批量細(xì)胞適應(yīng)的NDV 用于后續(xù)試驗。

TPCK-胰酶的優(yōu)化：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞離心全換液，使VCD 達(dá)到6.0×106個/mL 并接種至搖瓶，按MOI為0.005加入病毒液，分別添加0、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL 的TPCK-胰 酶。其它步驟同1.3。

稀釋比例的優(yōu)化：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按VCD 為6.0×106個/mL、工作體積為30 mL 計算需要吸取的體積，離心并收集上清液，按上清液∶新鮮培養(yǎng)基為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例稀釋，用30 mL稀釋好的上清液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)入搖瓶。將離心全換液（ME）組設(shè)置為對照組。按MOI為0.005加入病毒液，并添加5.0 μg/mL TPCK-胰酶，其它步驟同1.3。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用雙尾獨立t 檢驗法進(jìn)行顯著性檢驗。p＞0.05為不顯著；* ：p＜0.05 為顯著；**：p＜0.01 為極顯著；***：p＜0.001 為極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 BHK-21 單克隆細(xì)胞株的篩選結(jié)果 將BHKv002、BHK-v015、BHK-v011 細(xì)胞株按照不同體積比接種NDV，檢測各個細(xì)胞株的VCD 及NDV 的HA效價。結(jié)果顯示，無論采用哪種體積比，BHK-v015和BHK-v011 細(xì)胞在24 hpi 后VCD 均開始下降；而BHK-v002 細(xì)胞在該時間仍然維持較高的VCD，48 hpi 后VCD 逐漸下降。當(dāng)接種病毒體積比為0.1%、0.5%和1.0%時，BHK-v002 細(xì)胞接種的NDV 最高HA效價分別為8.3 log2HAU/25μL、8 log2HAU/25μL、8.3 log2HAU/25μL，顯著高于其它兩株細(xì)胞（p＜0.05，p＜0.01）（圖1）?？紤]到經(jīng)濟性，采用BHK-v002 細(xì)胞以0.1%的體積比接種NDV 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 BHK-v002 細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 在無血清培養(yǎng)基SF201 中分別利用懸浮批培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種模式培養(yǎng)BHK-v002 細(xì)胞，并檢測兩種培養(yǎng)模式下細(xì)胞的VCD 和活率，并計算傳代培養(yǎng)細(xì)胞的μ。結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)行懸浮批培養(yǎng)時，細(xì)胞接種密度約為1.0×106個/mL，培養(yǎng)至72 h 達(dá)到最高VCD，為12.0×106個/mL。此后，VCD 開始下降，培養(yǎng)至96 h 之前，活率均維持在95%以上（圖2A）。當(dāng)進(jìn)行懸浮傳代培養(yǎng)時，按VCD 為0.8×106個/mL～1.0×106個/mL 接種細(xì)胞，每48 h 傳代一次，連續(xù)傳8 代，各代次細(xì)胞生長最高密度均達(dá)到9.5×106個/mL ～9.8×106個/mL，μ維持在1.0 d-1～1.1 d-1（圖2B）?？梢?，BHK-v002 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基SF201中連續(xù)傳代，其生長具有穩(wěn)定性。

2.3 細(xì)胞適應(yīng)的NDV 的制備及病毒效價的測定結(jié)果 將雞胚適應(yīng)的NDV 按0.01%體積比在BHK-v002細(xì)胞中傳代，確定傳代代次，并制備適應(yīng)BHKv002 細(xì)胞的NDV。結(jié)果顯示，前3 代細(xì)胞，48 hpi后VCD 開始下降；而P4～P6 代細(xì)胞，24 hpi 后VCD即開始下降，且最高VCD 要低于P1～P3 代（圖3A）。隨著病毒在細(xì)胞中的傳代，收獲的P1～P4 代病毒液的TCID50逐漸提高，至P4 代時病毒液的TCID50為8.6 log10TCID50/mL，極顯著高于前3 代（p＜0.01），P5代趨于穩(wěn)定。但從P6 代開始，TCID50效價呈現(xiàn)下降的趨勢（圖3B）。重復(fù)P4 代（Re-P4）制備細(xì)胞適應(yīng)的NDV。將P3 代收獲的病毒液接入細(xì)胞培養(yǎng)物，48 hpi 收獲病毒液200 mL，分裝于凍存管中，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。?jīng)測定，制備的細(xì)胞適應(yīng)的NDV TCID50為8.8 log10TCID50/mL。

圖1 接種不同體積比的NDV 后3 株BHK-21 單克隆細(xì)胞的VCD（A）和HA 效價（B）檢測結(jié)果Fig.1 Result of viable cell density(A)and HA titer(B)of three BHK-21 monoclonal cells after inoculating with different volume ratios of NDV

圖2 無血清懸浮培養(yǎng)下BHK-v002 細(xì)胞的批培養(yǎng)生長曲線（A）和連續(xù)傳代生長曲線（B）Fig.2 Batch culture grow curve(A)and continuous passage grow curve(B)of BHK-v002 cells in serum-free suspension culture

2.4 MOI 的優(yōu)化結(jié)果 將NDV 以不同的MOI 接種至BHK-v002 細(xì)胞后，檢測VCD 和病毒HA 效價，并計算Svy。結(jié)果顯示，MOI 越低，接種病毒后所能達(dá)到的VCD 越高，最高HA 效價（HAmax）出現(xiàn)時間越晚；相反，MOI 越高，HAmax出現(xiàn)時間越早。MOI 為0.0001 和0.005 時，HAmax較高，分別為9.7 log2HAU/25 μL、9.6 log2HAU/25 μL。進(jìn)一步比較各組的Svy顯示，當(dāng)MOI 為0.0005 和0.005 時，結(jié)果較其它組高，分別為2 566.9、2 514.7 病毒顆粒/細(xì)胞（圖4），但均無統(tǒng)計學(xué)上的差異。綜合考慮HAmax和Svy 值，選擇MOI 0.005 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.5 TPCK-胰酶濃度的優(yōu)化結(jié)果 添加不同濃度的TPCK-胰酶，檢測接毒后細(xì)胞VCD 和病毒HA 效價。結(jié)果顯示，當(dāng)不添加TPCK-胰酶時，24 hpi 后VCD 開始下降且檢測不到病毒HA 效價；2.5 μg/mL TPCK-胰酶組較5.0 μg/mL～10.0 μg/mL TPCK-胰酶組，細(xì)胞生長及產(chǎn)毒均較差；其中5.0 μg/mL TPCK-胰酶組的HAmax為9.2 log2HAU/25 μL，均高于其它組的HAmax，并且顯著高于2.5 μg/mL TPCK-胰酶組（p＜0.05）（圖5）。后續(xù)試驗將TPCK-胰酶濃度設(shè)置為5.0 μg/mL，既能保證病毒具有較強的感染力，也可獲得較高的病毒產(chǎn)量。

圖4 不同MOI 對NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果Fig.4 Effect of different MOI on proliferation of NDV in BHK-v002 cells

圖5 TPCK-胰酶濃度對NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果Fig.5 Effect of TPCK-trypsin concentration on proliferation of NDV in BHK-v002 cells

2.6 稀釋比例的優(yōu)化結(jié)果 在基于細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)NDV的過程中，隨培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物被大量消耗，代謝副產(chǎn)物不斷產(chǎn)生，并最終影響細(xì)胞生長和病毒生產(chǎn)，因此，培養(yǎng)過程中需要補充新鮮培養(yǎng)基。由于全換液（ME）操作繁瑣，所以采用新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞液的方式補充病毒生產(chǎn)期間所需營養(yǎng)物，并降低代謝副產(chǎn)物濃度。結(jié)果顯示，補加的新鮮培養(yǎng)基越多，接種病毒后細(xì)胞的生長越接近于ME 對照組。培養(yǎng)上清液與新鮮培養(yǎng)基以2∶1～1∶2比例稀釋時，病毒HAmax均能達(dá)到8.5 log2HAU/25 μL。當(dāng)培養(yǎng)上清液與新鮮培養(yǎng)基的比例為2∶1 和1∶1 時，二者的Svy 相當(dāng)，分別為1 724.5 和1 749.3 病毒顆粒/細(xì)胞（圖6）?？紤]到生產(chǎn)的經(jīng)濟性，選擇細(xì)胞液與培養(yǎng)基的比例為2∶1（20 mL 細(xì)胞液+10 mL 培養(yǎng)基），即將細(xì)胞從9.0×106個/mL稀釋到6.0×106個/mL接種病毒。

圖6 稀釋比例對NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果Fig.6 Effect of dilution ratio on proliferation of NDV in BHK-v002 cells

2.7 無血清懸浮培養(yǎng)NDV 工藝的建立 將20 mL 生長至48 h 約9.0×106個/mL 的BHK-v002 細(xì)胞接種至搖瓶，補充10 mL 新鮮培養(yǎng)基。按MOI 0.005 加入病毒液，并添加5.0 μg/mL 的TPCK-胰酶，檢測接毒后VCD、HA效價及TCID50效價。結(jié)果顯示，接種病毒后24 h達(dá)最高VCD，此后逐漸下降，培養(yǎng)至144 h；接毒后，病毒HA效價逐漸升高，至接種病毒后144 h達(dá)最高水平，為8.5 log2HAU/25 μL，TCID50在細(xì)胞培養(yǎng)至96 h，即接毒后48 h 達(dá)最大值，為7.9 log10TCID50/mL（圖7）。通過計算，Svy 為1 685.9 病毒顆粒/細(xì)胞?？傊瑧腋HK-v002 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基SF201 中具備高密度生長能力以及優(yōu)異的產(chǎn)毒能力，可能成為ND疫苗工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)秀候選細(xì)胞。

圖7 在NDV 最適增殖條件下，BHK-v002 細(xì)胞的VCD 及NDV 的效價檢測結(jié)果Fig.7 Results of VCD and titers of NDV in BHK-v002 cells under optimal proliferation conditions

3 討 論

在基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)NDV 過程中，細(xì)胞株、病毒種子來源及工藝參數(shù)等諸多因素影響病毒產(chǎn)量。本研究結(jié)果顯示，NDV 在3 株BHK-21 單克隆細(xì)胞株中的增殖存在差異，其中BHK-v002 細(xì)胞中NDV 的增殖能力最強。張良艷等從制備的97 株單克隆化MDCK 細(xì)胞中，篩選到一株甲型H1N1 流感病毒高度適應(yīng)性的單克隆細(xì)胞株[16]。其中原因，可能是細(xì)胞表面病毒受體的類型和數(shù)量存在個體差異所致[17]，也可能因為不同細(xì)胞中病毒復(fù)制效率存在差異。

鑒于病毒在細(xì)胞中增殖存在適應(yīng)過程，本研究將NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中連續(xù)傳代，傳至P4 和P5代，病毒效價逐漸穩(wěn)定，P6 代病毒效價開始下降；P1～P3 代病毒在48 hpi 達(dá)到最高VCD，而P4～P6 代病毒最高VCD 提前24 h，并且低于前3 代。這一結(jié)果與Yurchenko 等的研究結(jié)果相似，將4 株不同來源的NDV 在貼壁Vero 細(xì)胞中傳至P7 或P8 代后，病毒效價趨于穩(wěn)定；傳代過程中除了TCID50效價的增加，細(xì)胞單層中死細(xì)胞的聚集（病毒作用的表現(xiàn)）更明顯且出現(xiàn)的時間更早[18]。

MOI 是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。MOI 過低，感染細(xì)胞的病毒數(shù)量不夠，易造成大量細(xì)胞浪費；而高M(jìn)OI 意味著需要準(zhǔn)備大量的病毒。為了獲得足夠多的病毒，必然要反復(fù)增殖病毒，不僅制備過程繁瑣，而且會帶來病毒學(xué)上的“代次效應(yīng)”，也就是連續(xù)擴增而使病毒活性下降的問題。此外，有研究顯示，缺陷干擾病毒顆粒會影響正常病毒的增殖，在高M(jìn)OI 條件下這種現(xiàn)象尤為明顯[19]。因此，MOI 的優(yōu)化是工藝建立過程中重要的步驟。本研究結(jié)果顯示，MOI 越高，病毒HAmax出現(xiàn)的時間越早；而MOI 越低，病毒HAmax的延遲期越長。在Shittu[11]和Audsley[19]的研究中同樣也觀察到這一現(xiàn)象，高M(jìn)OI 導(dǎo)致病毒同步生長，比低MOI 更早達(dá)到病毒效價的峰值。NDV 弱毒株感染細(xì)胞時常需添加適量的胰酶，這是因為胰酶能將NDV 的融合蛋白（F）不具活性的前體F0 水解成有活性的F1 和F2，從而介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合[20]。本研究結(jié)果顯示，不添加TPCK-胰酶組檢測不到病毒HA 效價。因此，胰酶的添加是NDV 弱毒株感染細(xì)胞所必須的。流感病毒的增殖也需要添加胰酶，病毒才能有效的增殖[21]。隨著胰酶濃度的提高，5.0 μg/mL 實驗組的HA 效價顯著高于2.5 μg/mL 實驗組，而7.5 μg/mL 和10 μg/mL 實驗組的病毒HA 效價出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因為高濃度的胰酶會使病毒降解[21]。

本研究篩選了適于NDV 增殖的BHK-21 單克隆細(xì)胞株，并將雞胚適應(yīng)的NDV 在篩選獲得的細(xì)胞株（BHK-v002）中傳至P4 代，又獲得細(xì)胞適應(yīng)的NDV。在確定的最佳病毒增殖條件下，HAmax達(dá)到8.5 log2HAU/25 μL，Svy 達(dá)1 685.9 病 毒 顆 粒/細(xì) 胞，最高TCID50效價為7.9 log10TCID50/mL。在達(dá)到相當(dāng)TCID50效價條件下，本研究利用懸浮培養(yǎng)BHK-v002細(xì)胞生產(chǎn)的NDV 比貼壁BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)的NDV 高0.5 log2HAU/25 μL[9]。目前關(guān)于ND 細(xì)胞苗的研究多集中在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)上，因此，在無血清培養(yǎng)基中具備高密度生長能力和優(yōu)異的病毒增殖能力的BHK-v002 細(xì)胞，有望成為ND 疫苗生產(chǎn)的理想候選細(xì)胞。

本研究把懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于ND 疫苗的制備，建立了基于BHK-21 細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)體系中的NDV 生產(chǎn)工藝，為ND 細(xì)胞苗的工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持，也為不同細(xì)胞系中其它病毒疫苗的生產(chǎn)提供方法借鑒。