胡世洋，王國慶，屈海峰，徐友海，寧艷春，岳春雨，宋偉光

(1.中國石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.國投生物吉林有限公司，吉林 長春 130022；3.中國石油吉林石化公司 倉儲(chǔ)中心，吉林 吉林 132021)

目前，國外企業(yè)普遍采用濃醪發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高濃度乙醇發(fā)酵技術(shù)的突破[1-9]，實(shí)現(xiàn)濃醪發(fā)酵技術(shù)，需解決高底物濃度物料輸送及其對(duì)酵母活性抑制的問題。為解決上述關(guān)鍵技術(shù)問題，一方面需要優(yōu)化玉米漿濃度、液化酶和糖化酶添加量，使物料黏度指標(biāo)滿足燃料乙醇裝置要求[10]；另一方面需要對(duì)乙醇發(fā)酵調(diào)控指標(biāo)進(jìn)行研究，確定合理的營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加量及發(fā)酵工藝控制參數(shù)，達(dá)到提高酵母繁殖力、發(fā)酵力及環(huán)境耐受力的目的[11]。

乙醇發(fā)酵過程是一種極其復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，不僅具有一般非線性系統(tǒng)的時(shí)變性、非線性、關(guān)聯(lián)性、不確定性等特點(diǎn)[12-13]，而且由于發(fā)酵過程中的一些重要參數(shù)(如生物質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度)都不可以在線測(cè)量，所以發(fā)酵過程的控制比一般的非線性系統(tǒng)更加復(fù)雜[14]。在高濃度乙醇發(fā)酵體系中，高濃度底物糖和高濃度產(chǎn)物乙醇會(huì)給細(xì)胞帶來滲透壓脅迫和乙醇抑制[15]。除產(chǎn)物和底物脅迫抑制外，發(fā)酵過程中還存在其他脅迫因素，如發(fā)酵溫度和廢糟液循環(huán)過程鹽離子和副產(chǎn)物積累導(dǎo)致的抑制效應(yīng)等。因此，國內(nèi)外在乙醇發(fā)酵的研究過程中，研究者們通過添加營養(yǎng)物質(zhì)或脅迫保護(hù)性物質(zhì)策略來提高發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度[16-17]。

高濃度乙醇發(fā)酵工藝具有高發(fā)酵效率、高轉(zhuǎn)化率、低殘?zhí)呛凸?jié)約能源等特點(diǎn)，可增加產(chǎn)量，顯著提高經(jīng)濟(jì)效益。岳國軍院士在中國酒精工業(yè)年會(huì)(2017年)上對(duì)國內(nèi)外乙醇生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)現(xiàn)狀進(jìn)行了分析。美國企業(yè)φ(乙醇)>15%，其中34%的企業(yè)φ(乙醇)=19%，而國內(nèi)企業(yè)φ(乙醇)=12.5%～14.0%。并且，提高乙醇發(fā)酵濃度，可減少玉米粉調(diào)漿用水量，使蒸餾后的發(fā)酵成熟醪(酒糟液)經(jīng)臥式螺旋離心機(jī)后酒糟清液量大幅降低，有利于在干酒糟及其可溶物(distillers dried grains with solubles，DDGS)生產(chǎn)中減少蒸發(fā)設(shè)備投入和能源消耗。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

玉米糖化醪液、乙醇發(fā)酵醪液、磷酸氫二銨：農(nóng)業(yè)級(jí)，云天化集團(tuán)有限責(zé)任公司；酵母菌：安琪超級(jí)釀酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。

磷酸氫二鉀：天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫酸鉀：天津市塘沽新華化工廠；葡萄糖：天津市化學(xué)試劑一廠；以上試劑均為分析純。

高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography，HPLC)：LC-20A plus，日本島津公司；潔凈工作臺(tái)：W-CJ-1FDS，上海昕儀公司；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：3870ELVC-D，以色列騰氏公司；高速冷凍離心機(jī)：Sigma3-30K，德國Sigma公司；生化培養(yǎng)箱：HWS-250，立式振蕩培養(yǎng)箱全溫?fù)u床：ZQPL-200，天津萊玻特瑞公司；電子顯微鏡熒光系統(tǒng)：CKX53，日本奧林巴斯公司；微孔板光譜儀：Plus384，美國美谷分子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

吉林燃料乙醇公司采用的是分步糖化連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工藝(從預(yù)發(fā)酵罐到8號(hào)發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵)，而作者是采用搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)分步糖化間歇發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行探索研究，從而實(shí)現(xiàn)高ρ(乙醇)發(fā)酵技術(shù)的突破。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 分步糖化間歇發(fā)酵生產(chǎn)工藝

高質(zhì)量濃度糖化醪原料制備：將糖化醪進(jìn)行固液分離(3 000 g/min，離心10 min)，在分離得到的糖化醪上清液中添加一定量的葡萄糖，110 ℃條件下滅菌30 min，室溫條件下靜置20 h，再分析糖化醪上清液中的ρ(葡萄糖)。

發(fā)酵醪液中酵母活性分析：將稀釋一定倍數(shù)后的發(fā)酵醪液滴加到固體平板上，再利用涂布棒均勻涂布后，30 ℃條件下，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行酵母菌落計(jì)數(shù)，從而判斷酵母活性。

發(fā)酵：在300 mL搖瓶(裝液量為100 mL)中，將發(fā)酵醪液和高ρ(糖化醪液)按一定體積比進(jìn)行混合封膜后進(jìn)行厭氧發(fā)酵。發(fā)酵溫度為30～36 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵周期為30～54 h，定期取樣(取樣量1 mL)分析醪液中主要成分變化情況。

1.2.2ρ(還原糖)、ρ(葡萄糖)及ρ(乙醇)的測(cè)定方法

還原糖采用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS)測(cè)定[18]；葡萄糖和乙醇采用液相色譜(NREL/TP-510-42623 January 2008)進(jìn)行測(cè)定。首先，將待測(cè)樣品1 mL放入2.0 mL離心管中10 000 r/min離心5 min，將上清液稀釋10倍后用0.22 μm的水系濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中；再用HPLC(檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；色譜柱：HPX-87H；流速：0.6 mL/min；流動(dòng)相：0.005 mol/L 硫酸；柱溫：55 ℃)進(jìn)行樣品成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米糖化醪和發(fā)酵醪液主要組分分析

實(shí)驗(yàn)所用的玉米糖化醪液和發(fā)酵醪液由工廠提供，其中，發(fā)酵醪液為工廠主1發(fā)酵罐中的醪液，醪液酵母處于生長穩(wěn)定期(發(fā)酵16 h)，醪液中酵母數(shù)量為4.05×108CFU/mL。具體組分分析結(jié)果見表1。

表1 工廠玉米糖化醪和發(fā)酵醪液主要組分分析1)

1)“-”表示未檢出，下同。

由表1可知，工廠所提供的發(fā)酵醪液中酵母活性較高，適合作為酵母種子液開展工藝優(yōu)化研究，然而，所提供的糖化醪液的ρ(糖)不適合開展高ρ(乙醇)發(fā)酵工藝的研究。

2.2 ρ(糖化醪糖)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

為了開展高ρ(乙醇)發(fā)酵工藝研究，在工廠所提供的糖化醪液中分別補(bǔ)加170、210 g葡萄糖，使糖化醪液中ρ(葡萄糖)=280、316 g/L，記為1#、2#實(shí)驗(yàn)，ρ(還原糖)=308、344 g/L。并將配制的高質(zhì)量濃度糖化醪(糖化醪液中未添加磷酸氫二銨)與發(fā)酵醪液[發(fā)酵醪液中ρ(磷酸氫二銨)=0.2 g/L]按體積比1∶1混合后，在三角瓶中開展乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察ρ(糖化醪糖)對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響。其中，發(fā)酵溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 ρ(糖化醪糖)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響 ρ/(g·L-1)

由表2可知，1#和2#發(fā)酵54 h時(shí)ρ(乙醇)均可達(dá)到124 g/L，ρ(葡萄糖)=3、14 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，提高ρ(糖化醪糖)后，可實(shí)現(xiàn)高ρ(乙醇)發(fā)酵，但過高的增加ρ(醪液糖)會(huì)造成發(fā)酵成熟醪液ρ(殘?zhí)?偏高，不利于工廠降低生產(chǎn)成本。所以需要對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到提高酵母發(fā)酵力及環(huán)境耐受力的目的。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

為了考察不同發(fā)酵溫度對(duì)乙醇發(fā)酵效果的影響，在三角瓶中依據(jù)工廠生產(chǎn)工藝條件開展了乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。其中，發(fā)酵醪與高質(zhì)量濃度糖化醪[ρ(葡萄糖)=270 g/L]按體積比1∶1.5混合，磷酸氫二銨添加量為0.2 g/L，發(fā)酵溫度分別為30、32、34、36 ℃，記為1#、2#、3#、4#發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵周期為48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵溫度對(duì)乙醇發(fā)酵的影響情況 ρ/(g·L-1)

由表3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=117.2 g/L，ρ(葡萄糖)=0.1 g/L。而當(dāng)發(fā)酵溫度在32～36 ℃時(shí)，發(fā)酵48 h后，ρ(乙醇)≈115 g/L，ρ(葡萄糖)=1.2～9.8 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，30 ℃的發(fā)酵溫度是安琪超級(jí)釀酒活性干酵母最佳活性溫度。

通過對(duì)發(fā)酵48 h的發(fā)酵醪液進(jìn)行固體平板培養(yǎng)，進(jìn)一步考察了不同發(fā)酵溫度對(duì)酵母生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為1#酵母數(shù)量為4.5×108CFU/mL，2#酵母數(shù)量為5.5×108CFU/mL，3#酵母數(shù)量為0.18×108CFU/mL，4#酵母數(shù)量為0.11×108CFU/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，發(fā)酵溫度在30、32 ℃時(shí)，都可以維持較高的酵母數(shù)量(活性)。

2.4 ρ(磷酸氫二銨)、ρ(磷酸氫二鉀)及ρ(硫酸鉀)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

增加ρ(鉀離子)有利于促進(jìn)酵母碳水化合物的代謝，而無機(jī)磷是細(xì)胞中核酸、核蛋白等的成分，是許多輔酶和高能磷酸化合物的組分，又是氧化磷酸化的必需元素，而且磷酸鹽類也是維持培養(yǎng)基緩沖性的主要物質(zhì)。所以，利用Minitab 16軟件中的Placket-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鉀3種營養(yǎng)鹽對(duì)乙醇發(fā)酵效果的影響。采用PB實(shí)驗(yàn)考慮各因素間存在交互作用并為下一步開展中心組合實(shí)驗(yàn)挑選優(yōu)化因素。

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是以ρ(營養(yǎng)鹽)=2 g/L為中心點(diǎn)，2 g/L為步長，發(fā)酵醪與高質(zhì)量濃度糖化醪[ρ(葡萄糖)=316 g/L]按體積比1∶1混合，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵周期為48 h，開展乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，7#和12#是空白對(duì)照樣品，發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=114.9～118.9 g/L，ρ(葡萄糖)降至18.7～25.8 g/L。2#、4#、5#、6#、8#、9#、11#是添加磷酸氫二銨的醪液樣品，發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=125.7～129.5 g/L，ρ(葡萄糖)降至4.7～7.5 g/L。1#、3#、10#、13#是添加磷酸氫二鉀、硫酸鉀的醪液樣品，發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=106.9～116.0 g/L，ρ(葡萄糖)降至28.3～39.4 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，磷酸氫二銨對(duì)乙醇發(fā)酵有促進(jìn)作用，而磷酸氫二鉀和硫酸鉀對(duì)乙醇發(fā)酵無促進(jìn)效果。

表4 磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鉀營養(yǎng)成分對(duì)乙醇發(fā)酵的影響 ρ/(g·L-1)

在上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用Minitab 16軟件中的PB設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵30 h時(shí)的發(fā)酵數(shù)據(jù)進(jìn)行了PB分析并篩選出影響發(fā)酵效果的顯著性因素，結(jié)果見表5。

表5 磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鉀對(duì)乙醇發(fā)酵效果的PB分析

由表5可知，磷酸氫二銨的P值為0.000，小于0.05，表明磷酸氫二銨對(duì)乙醇發(fā)酵有顯著影響，而磷酸氫二鉀和硫酸鉀的P值分別為0.955和0.965，均大于0.05，表明磷酸氫二鉀和硫酸鉀對(duì)乙醇發(fā)酵無促進(jìn)作用。上述分析結(jié)果說明，氮源(氮元素)是乙醇發(fā)酵的主要限制因素。

2.5 優(yōu)化ρ(糖)及ρ(磷酸氫二銨)

為了實(shí)現(xiàn)高ρ(乙醇)發(fā)酵效果利用Minitab 16軟件設(shè)計(jì)了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵醪與高質(zhì)量濃度糖化醪按體積比1∶(0.3～1.7)混合，磷酸氫二銨添加量為1.25～2.75 g/L，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵周期為48 h。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6，響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)見圖2。

表6 ρ(磷酸氫二銨)及ρ(葡萄糖)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

由表6可知，中心點(diǎn)樣品發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=137 g/L，ρ(葡萄糖)<1.7 g/L。醪液初始ρ(葡萄糖)=224.6～235.9 g/L，ρ(磷酸氫二銨)=2～2.5 g/L，發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=135.0～138.0 g/L，ρ(葡萄糖)=14～28 g/L。而當(dāng)醪液初始ρ(葡萄糖)=116.8～149.9 g/L，ρ(磷酸氫二銨)=1.5～2.5 g/L，發(fā)酵48 h，ρ(乙醇)=112.0～122.0 g/L，ρ(葡萄糖)<0.3 g/L。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，發(fā)酵醪液ρ(葡萄糖)達(dá)到一定上限后，酵母將不能把多補(bǔ)加的糖轉(zhuǎn)化為乙醇，即使通過提高醪液中ρ(磷酸氫二銨)也達(dá)不到提高乙醇產(chǎn)率的效果。

在上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用Minitab16軟件對(duì)發(fā)酵48 h的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了響應(yīng)面分析，得到了ρ(葡萄糖)、ρ(磷酸氫二銨)與ρ(乙醇)相互關(guān)聯(lián)的等值線圖，從左→右分別代表不同ρ(乙醇)(單位：g/L)，見圖2。

圖2 48 h ρ(葡萄糖)、ρ(磷酸氫二銨)與ρ(乙醇)相互關(guān)聯(lián)的等值線圖

由圖2可知，發(fā)酵醪液中ρ(葡萄糖)直接影響ρ(乙醇)，說明提高ρ(葡萄糖)是提高ρ(乙醇)的決定因素，其次是ρ(磷酸氫二銨)因素。

3 結(jié) 論

目前，國內(nèi)的燃料乙醇企業(yè)大部分使用安琪酵母股份有限公司所提供的釀酒干酵母，而該酵母在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)φ(乙醇)=12.5%～14.0%。在這種較低的φ(乙醇)下，不利于企業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展。所以，作者研究的目的是在工廠現(xiàn)有工藝條件的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)其高φ(乙醇)發(fā)酵技術(shù)的突破。實(shí)驗(yàn)以燃料乙醇企業(yè)實(shí)際物料為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在三角瓶中開展乙醇發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。當(dāng)發(fā)酵醪與高質(zhì)量濃度糖化醪[ρ(葡萄糖)=316 g/L)]按1∶1體積比混合后，補(bǔ)加2 g/L磷酸氫二銨，并在30 ℃條件下，發(fā)酵48 h，實(shí)現(xiàn)了醪液ρ(乙醇)=137 g/L[φ(乙醇)=17%]，醪液ρ(葡萄糖)<1.7 g/L。以吉林燃料乙醇公司[φ(乙醇)=14%]糖醇轉(zhuǎn)化率按47%折算，發(fā)酵醪初始ρ(葡萄糖)=238.29 g/L，而體積比1∶1混合后醪液初始ρ(葡萄糖)=277.15 g/L，經(jīng)計(jì)算得出糖醇轉(zhuǎn)化率為49.43%。上述實(shí)驗(yàn)為提高燃料乙醇企業(yè)乙醇發(fā)酵濃度提供了技術(shù)支持。