姚莉洪 張美 黃美暢 萬梓欣 張偉龍 楊肖 楊名仲 陳宇 湯亞玲

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院病理科，成都 610041

口腔頜面部由于解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，送檢標本中通常會含有牙、骨組織、骨腫瘤及鈣化病灶，因此，在病理制片前需用脫鈣劑去除骨組織中的鈣鹽再進行切片。目前，使用較多的脫鈣劑有以硝酸為主的酸性脫鈣劑和以乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）為代表的螯合脫鈣液。EDTA較溫和，染色效果較好，但組織滲透性差，脫鈣耗時長，影響其應(yīng)用及推廣[1]。因此，人們開始嘗試使用方便、耗時短的酸類脫鈣劑，其中硝酸是病理工作中使用最廣的酸類脫鈣劑[2]。硝酸脫鈣迅速，得到臨床醫(yī)生認可。但硝酸是強酸，對組織有酸化作用，致使常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后胞漿著色濃、胞核著色淺，組織細胞顯微結(jié)構(gòu)模糊，切片效果差。本研究旨在探究牙、骨等硬組織酸脫鈣標本HE染色前處理方法，改善硬組織因酸脫鈣后pH變化而引起的切片質(zhì)量欠佳及HE染色組織結(jié)構(gòu)不清的現(xiàn)象。

1 材料和方法

1.1 標本來源

隨機選取2015年1—6月四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院病理科手術(shù)送檢的口腔頜面部來源的含硬組織標本20例。

1.2 處理方法

10%硝酸脫鈣液對硬組織標本進行脫鈣，脫鈣完成判斷標準如下。1）物理方法：用手觸及標本柔軟、不刺手或大頭針無阻力刺入組織標本[3]。2）化學(xué)方法：5%氫氧化銨儲存液和5%草酸銨儲存液配制檢測工作液，與脫鈣液混合，若無沉淀則脫鈣完全。3）射線法：X線看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)[4]。

脫鈣后根據(jù)以下3種處理方式分組觀察。1）常規(guī)處理組：酸脫鈣后將樣本經(jīng)流水沖洗3 h以上。2）濃氨水處理組：酸脫鈣后將樣本經(jīng)流水沖洗30 min以上，25%濃氨水浸泡1～2 h。3）飽和碳酸鋰處理組：酸脫鈣后將樣本經(jīng)流水沖洗30 min以上，飽和碳酸鋰溶液（100 mL雙蒸水+1.5 g碳酸鋰）浸泡1～2 h。

1.3 染色切片質(zhì)量評判

1.3.1 切片質(zhì)量評價 組織切片外觀完整，無脫片、卷片，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整，無掉片缺損，對后續(xù)透明封片工作無影響，判定為良好，否則視為欠佳。

1.3.2 HE染色評價 細胞形態(tài)完好，胞核、胞質(zhì)著色明顯，核仁清晰，胞漿染色鮮艷，判定為良好，否則視為欠佳。

1.3.3 制片效果滿意度 每一例標本均由3位病理醫(yī)師評閱，其中2位或3位病理醫(yī)師滿意則記為良好，否則記為欠佳。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 6.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

3組HE染色圖見圖1、2。

圖1 典型圖例1 HE染色Fig 1 Typical picture 1 HE staining

圖2 典型圖例2 HE染色Fig 2 Typical picture 2 HE staining

與常規(guī)處理組（圖1上、圖2上）相比，飽和碳酸鋰處理組（圖1中、圖2中）在切片質(zhì)量、HE染色效果方面具有明顯優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為：HE染色著色強，胞核染色清晰，核仁明顯；胞漿染色鮮艷；切片完整，無明顯脫片、卷片，對后續(xù)透明封片工作無影響，病理醫(yī)師對切片滿意度高（P＜0.05）（表1）。濃氨水處理組（圖1下、圖2下）在切片質(zhì)量、HE染色效果及病理醫(yī)師滿意度方面優(yōu)勢均不明顯，鏡下組織結(jié)構(gòu)層次不清晰，HE著色較弱，胞核清晰度欠佳，胞核與胞漿對比度差。

表1 脫鈣后3種處理方法切片的質(zhì)量、HE染色效果及醫(yī)師滿意度比較Tab 1 Comparison of section quality, HE staining effect and physician satisfaction after decalcification with three methods

3 討論

針對硝酸脫鈣造成組織“過酸”這一弊端，本實驗在硝酸脫鈣后通過濃氨水或飽和碳酸鋰溶液處理標本，以期緩解組織“過酸”，提高切片質(zhì)量。結(jié)果顯示：與常規(guī)方法相比，硝酸脫鈣后經(jīng)濃氨水或飽和碳酸鋰溶液處理后組織切片質(zhì)量及HE染色效果更具有優(yōu)勢，盡管濃氨水與常規(guī)處理相比無統(tǒng)計學(xué)差異。其可能機制為：氨水和飽和碳酸鋰溶液為堿性溶液，可滲透到硝酸脫鈣后的組織細胞內(nèi)并除酸或使酸中和，使組織切片對蘇木素嗜染性更強、更穩(wěn)定，從而提高了蘇木素著色能力，減少伊紅過著色，胞核與胞質(zhì)對比度好。另外，氨水和飽和碳酸鋰溶液處理經(jīng)硝酸脫鈣的標本，縮短了傳統(tǒng)方法硝酸脫鈣后流水沖洗標本時間、操作方便，便于實施及推廣[5-6]。但濃氨水處理硝酸脫鈣后標本，切片質(zhì)量及HE染色效果均不及飽和碳酸鋰溶液，此現(xiàn)象是否與濃氨水作用時間不足或濃氨水作用緩慢等因素有關(guān)有待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。