樸哲浩，王天嬌，金 麗，崔 燕

(1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 溫州325000；2．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院 心血管內(nèi)科；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科)

心肌梗死是臨床上常見的急危重癥，嚴(yán)重影響患者的壽命和生存質(zhì)量。心肌纖維化是心肌梗死后主要的病理過程，可致心功能障礙、心律失常甚至猝死[1]。因此，有效預(yù)防、抑制和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，對提高心肌梗死患者的生存率及改善預(yù)后起著重要的作用。然而，目前對于心肌梗死后心肌纖維化的具體機(jī)制尚不完全清楚，故缺乏有效的干預(yù)措施。既往研究表明，組蛋白去乙?；?Histone Deacetylase，HDACs)在心血管系統(tǒng)中起著重要作用，對心肌纖維化亦有調(diào)控作用[2-5]。本研究通過建立心肌梗死小鼠模型，探討組蛋白去乙酰化酶在心肌纖維化中的作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

選擇8周齡SPF級CD-1雄性小鼠40只，體質(zhì)量35-40 g。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：H9C2細(xì)胞株(韓國全南大學(xué)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 試劑和儀器

沒食子酸(G7384)購自美國Sigma公司。心臟組織的總RNA分離試劑盒、TOP script RT Dry MIX 、SYBR Green PCR試劑盒。ANP鼠單克隆抗體、BNP 鼠單克隆抗體、Collagen Ⅰ鼠單克隆抗體、Fibronectin鼠單克隆抗體、MMP9鼠單克隆抗體、HDAC5鼠單克隆抗體；Masson 三色染色試劑盒，美國ABI 7500熒光定量PCR儀；微板紫外連續(xù)波長酶標(biāo)儀；蛋白電泳儀(韓國全南大學(xué)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物造模、H9C2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及給藥 ① 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，所有小鼠腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于鼠板，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，左心耳下方2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備心肌梗死模型。其中，隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。關(guān)閉胸腔，縫合，小鼠有自主呼吸后，關(guān)閉呼吸機(jī)，拔出氣管。再將造模成功后的20只小鼠隨機(jī)分為心肌梗死模型組及沒食子酸干預(yù)組，各組10只。沒食子酸干預(yù)組給予沒食子酸(100 mg/kg/d) 腹腔注射，假手術(shù)組和心肌梗死模型組腹腔注射等體積生理鹽水。連續(xù)給藥2 W。② 將H9C2 細(xì)胞株置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶細(xì)胞消化液制成細(xì)胞懸液，后將細(xì)胞接種到12孔板中，并分為：正常對照組、HDAC5過表達(dá)組、沒食子酸干預(yù)組。正常對照組未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，過表達(dá)組為HDAC5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，沒食子酸干預(yù)組經(jīng)HDAC5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并給予沒食子酸(藥物濃度100 μM)。

1.3.2心功能指標(biāo)檢測 2 W 藥物干預(yù)結(jié)束后，小鼠經(jīng)50 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，使用Vivid S5型小動(dòng)物超聲繪制小鼠二維超聲心動(dòng)圖進(jìn)行心臟超聲檢測，獲得各組M型超聲心動(dòng)圖，記錄小鼠左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)和舒張末期內(nèi)徑(LVEDD),并計(jì)算左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS%)=(LVEDD-LVESD)×100/LVEDD。

1.3.3Western blotting檢測心肌組織ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、HDAC4,HDAC5、HDAC7、HDAC9、MMP9、GAPDH 蛋白表達(dá) 80 mg心肌組織中加入500 μl細(xì)胞裂解液(20 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% Nonidet P-40，0.5% Sodium Deoxycholate，1 mmol/L EDTA，0.1% SDS，用前加 100 μg/mL PMSF)，充分勻漿后置于冰上裂解30 min。12 000×g 離心10 min，收集上清，加入5×SDS Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入封閉液稀釋的ANP(1∶1 000)、BNP(1∶1 000)、Collagen Ⅰ(1∶1 000)、Fibronectin (1∶1 000)、HDAC4 (1∶1 000)、 HDAC5(1∶1 000)、 HDAC7 (1∶1 000)、 HDAC9 (1∶1 000)、 MMP9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌3 次，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3 次，ECL顯影。

1.3.4RT-PCR檢測 采用H9C2細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取H9C2細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取質(zhì)量。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物分別為：HDAC5 F:AGCACCTCTTCACCACAGGT R:GTCCCATAGAGCAGGGTGTG MMP9 F:GAAGGCAAACCCTGTGTGTT R:AGGAAGA-CGAAGGGGAAGAC GAPDH F:GCATGGCCTTCCGTGTTCCT R:CCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCAT 據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系，設(shè)置熒光定量 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性，30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸30 s，39 個(gè)循環(huán)，制作溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后從儀器上讀取MMP9 mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.5Masson’s 染色檢測心肌膠原含量 心肌組織用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色7 min，酸性乙醇分化10 s，蒸餾水沖洗。Masson藍(lán)化液返藍(lán)3 min，蒸餾水沖洗。麗春紅品紅染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min。苯胺藍(lán)染色2 min，弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脫水20 s，無水乙醇脫水3 次，每次20-30 s。二甲苯透明3 次，每次2 min。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析心肌纖維化程度。膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)= 膠原纖維染色面積/組織切片總面積。

2 結(jié)果

2.1 沒食子酸對心肌梗死小鼠心功能指標(biāo)的影響

沒食子酸明顯改善心肌梗死后受損的心臟功能。結(jié)果如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，心肌梗死模型組小鼠LVEDD、LVESD顯著升高，LVFS則顯著降低(P<0.001)。而沒食子酸干預(yù)組與心肌梗死組比較，沒食子酸干預(yù)組小鼠LVEDD、LVESD顯著降低，LVFS顯著升高(P<0.001)。

圖1 超聲心動(dòng)圖觀察心肌梗死后心功能

2.2 沒食子酸對心肌梗死小鼠心肌組織膠原含量的影響

沒食子酸對心肌梗死后心肌纖維化有明顯抑制作用。結(jié)果如圖2 所示，假手術(shù)組小鼠細(xì)胞排列規(guī)整，少量膠原纖維(藍(lán)色)散在分布；心肌梗死模型組小鼠有大量膠原纖維增生且分布雜亂；沒食子酸干預(yù)組膠原纖維增生程度較心肌梗死模型組明顯降低。心肌梗死模型組小鼠心肌組織CVF 顯著高于假手術(shù)組， 沒食子酸干預(yù)組較心肌梗死模型組CVF顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖2 Masson 染色觀察心肌膠原含量

2.3 沒食子酸對心肌梗死小鼠心衰標(biāo)記物、心肌纖維化標(biāo)記物、組蛋白去乙?；?、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

沒食子酸降低心肌梗死后心力衰竭標(biāo)記物及纖維化標(biāo)記物基因的表達(dá)。結(jié)果如圖 3所示，與假手術(shù)組比較，心肌梗死模型組心肌組織ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、HDAC5、MMP9 蛋白表達(dá)均顯著升高。而沒食子酸干預(yù)組與心肌梗死模型組比較，沒食子酸干預(yù)組心肌組織ANP、BNP、Collagen Ⅰ、Fibronectin、 HDAC5、MMP9蛋白表達(dá)顯著降低。

2.4 沒食子酸對過表達(dá)HDAC5心肌細(xì)胞中MMP9蛋白及mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果如圖4 所示,與正常對照組比較，HDAC5過表達(dá)組MMP9蛋白及mRNA均顯著升高。而沒食子酸干預(yù)組與HDAC5過表達(dá)組比較，沒食子酸干預(yù)組MMP9蛋白及mRNA均顯著降低(P<0.001)。

圖3 檢測心肌組織心力衰竭標(biāo)記物、纖維化標(biāo)記物、HDAC、MMP蛋白表達(dá)水平

圖4 檢測HDAC5過表達(dá)時(shí)MMP9蛋白及m RNA 變化

3 討論

雖然介入、藥物等治療手段已在冠心病患者中廣泛應(yīng)用，但目前我國心肌梗死的發(fā)病率及死亡率仍呈逐年上升趨勢[6]。心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞缺血缺氧、神經(jīng)-體液等因素異常激活，引起心室負(fù)荷過重、心室重構(gòu)，所致心肌梗死后的心力衰竭是造成病死率居高不下的一個(gè)重要原因。心肌纖維化是心肌梗死后心室重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)，研究表明，多種細(xì)胞因子參與了該過程，包括：炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號調(diào)節(jié)等[7]，但具體的病理生理機(jī)制目前仍不明確。而沒食子酸的出現(xiàn)為解決上述問題提供了新的思路。

沒食子酸亦稱“五倍子酸”、“棓酸”，學(xué)名“3,4,5-三羥基苯甲酸”，分子式C7H6O5，廣泛存在于掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物中，是自然界存在的一種多酚類化合物。既往研究顯示沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性[8]，研究中亦發(fā)現(xiàn)沒食子酸可顯著改善肺纖維化[9]。本研究通過比較沒食子酸給藥前后心肌梗死小鼠的心功能參數(shù)、心肌組織病理形態(tài)變化及心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化，探究沒食子酸在心肌梗死中對心肌纖維化的抑制作用，及其與HDAC5信號通路的關(guān)系。

眾所周知，心肌纖維化作為心臟功能減退的病理基礎(chǔ)，以成纖維細(xì)胞增殖、膠原累積或細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征，最終引發(fā)心力衰竭甚至死亡[10,11]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心肌梗死模型組小鼠LVEDD 和LVESD 升高，LVFS降低，心肌膠原含量顯著升高，提示心肌梗死心功能受到嚴(yán)重影響。使用沒食子酸干預(yù)后，與心肌梗死模型組比較，小鼠LVEDD和LVESD 降低，LVFS升高，心肌膠原含量顯著減少，顯示心功能得到改善。另外，與假手術(shù)組比較，心肌梗死模型組小鼠心力衰竭及心肌纖維化標(biāo)記物ANP,BNP,Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白水平明顯升高，沒食子酸干預(yù)后ANP,BNP,Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白水平較心肌梗死模型組明顯下降。以上結(jié)果顯示，沒食子酸對心肌梗死后心力衰竭、心肌纖維化有明顯改善作用。

既往的研究表明，組蛋白去乙?；?HDAC)在心肌纖維化中有著重要作用，18種HDAC家族成員各自作為壓力信號對纖維化進(jìn)行調(diào)控[12-18]，同時(shí)，已明確基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) 作為心肌纖維化靶點(diǎn)影響心肌纖維化過程[19,20]。本研究顯示，與假手術(shù)組比較，心肌梗死模型組小鼠HDAC5、MMP9蛋白水平明顯升高，而沒食子酸干預(yù)組與心肌梗死模型組比較HDAC5、MMP9蛋白水平明顯降低。在心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組比較， HDAC5過表達(dá)組MMP9 蛋白及mRNA水平明顯升高，而沒食子酸干預(yù)組MMP9 蛋白及mRNA水平則較HDAC5過表達(dá)組顯著下降。

綜上所述，在心肌梗死心肌纖維化過程中，HDAC5表達(dá)水平明顯升高，而沒食子酸可通過HDAC5信號通路進(jìn)而下調(diào)MMP9進(jìn)一步抑制心肌纖維化，能夠?yàn)樾募」Ｋ篮笮募±w維化的藥物治療提供一定參考依據(jù)。