管佳寧 徐盈盈 徐君卿

流行病學研究顯示，在非冠狀動脈重癥監(jiān)護室，膿毒癥是導致危重患者死亡的主要因素[1]。膿毒癥可導致急性肺損傷（ALI），甚至發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）[2]。ALI 的病理表現為肺泡毛細血管膜通透性增加、中性粒細胞向肺的無限制浸潤、嚴重肺水腫和彌漫性肺泡損傷[3]。盡管對膿毒癥誘導的ALI 相關機制的研究取得顯著進展，但目前肺保護性通氣是唯一有效干預治療方法，能夠降低ALI 發(fā)病時的死亡率[4]。研究顯示，ARDS 患者俯臥位可以潛在地改善氧合，減少肺損傷[5]。住院前使用抗血小板治療，可以降低ALI 發(fā)生率[6]。鼠尾草酚是迷迭香屬植物的主要有效成份，具有抗炎、抗氧化、抗增殖和抗纖維化的特性。研究顯示，鼠尾草酚能改善脂多糖（LPS）導致的肺損傷和肺微循環(huán)障礙，但具體機制尚不完全清楚[7]。有證據表明，轉化受體電位陽離子通道亞家族M 成員6（TRPM6）和TRPM7 通道激酶基因是重要的調節(jié)因子，能夠調節(jié)多種身體疾病的發(fā)展進程[8]。因此，本研究觀察鼠尾草酚對膿毒癥模型大鼠TRPM6 和TRPM7 表達的影響，探討膿毒癥誘導的肺損傷的保護作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選用健康SPF 級成年雄性SD 大鼠50 只，7～8 周齡，體質量220～250g，購自浙江大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號:SCXK（浙）2018-0009，實驗動物使用許可證號:SYXK（浙）2018-0014，質量合格證號:201811036。動物飼養(yǎng)在SPF 環(huán)境中自由進食和飲水，控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12h/12h），動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究經浙江省臺州市中心醫(yī)院倫理委員會審核，審批號:（2018）倫審（279）號。

1.2 實驗藥物 鼠尾草酚（美國開曼化學公司，純度:99.9%，批號89800），用生理鹽水配置成0.5、1.0、2.0mg/mL 混懸液備用；LPS（美國Sigma 公司，批號P0789-10ML），用生理鹽水配置成1mg/mL 混懸液備用。

1.3 主要試劑及儀器 蘇木素染色液、BCA 蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所，批號C0107、P0033）；髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建城生物工程有限公司，批號A003-1-4、A004-1-3）；白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號MM-0670R22、MM-0670R95）；Trizol Reagent RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號DP421）；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反轉錄試劑盒、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit 熒光定量PCR 試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號RR047A、TK08045）；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉切片機等病理配套設備（德國Leica 公司）；MB-3100-B 型血氣分析儀（上海涵飛醫(yī)療器械有限公司）；HBS-1096B 酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo 公司）；7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 用隨機數字表法將50 只大鼠分為對照組、模型組、鼠尾草酚低、中、高劑量組，每組10 只。模型組、鼠尾草酚低、中、高劑量組尾靜脈給予LPS 10mg/kg（1mg/mL 混懸液，注射體積10mL/kg）制備膿毒癥大鼠肺損傷模型[9]，對照組尾靜脈給予生理鹽水（10mL/kg）。造模1h 后鼠尾草酚低、中、高劑量組分別股靜脈給予鼠尾草酚，劑量依次為5、10、20mg/kg（0.5、1.0、2.0mg/mL 混懸液，注射體積10mL/kg），對照組和模型組分別股靜脈給予生理鹽水（10mL/kg），24h 后麻醉大鼠，股動脈取血，用血氣分析儀檢測氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）的水平，計算動脈血氧分壓/吸入氣氧濃度（PaO2/FiO2）的比值，麻醉處死大鼠后分離肺組織進行相關檢測。

2.2 肺組織病理學檢查 每組取5 只大鼠右肺上葉進行福爾馬林固定，經脫水、包埋、切片（3μm），進行蘇木精-伊紅(HE)染色，用光學顯微鏡觀察肺組織學變化。

2.3 肺濕重/干重（W/D）比計算 每組取5 只大鼠分離左肺上葉，用濾紙吸棄肺組織表面水分，稱濕重(W)，用恒溫干烤箱于70℃烤至恒重，稱取余重即為干重（D），計算W/D 比值。

2.4 肺組織MPO 和SOD 活性檢測 每組取5 只大鼠取部分左肺上葉組織，用預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，按1mL/100mg 的比例加入PBS，用電動勻漿器將組織制成勻漿，4℃，12000rpm 離心20min，取上清，根據試劑盒說明書檢測肺組織中MPO 和SOD活性。

2.5 支氣管肺泡灌洗液蛋白、IL-6 和TNF-ɑ 含量測定 每組取5 只小鼠結扎右側主支氣管近端和氣管遠端，在氣管結扎下端用0.3mL 預冷生理鹽水進行右肺灌洗，重復3 次，回收支氣管肺泡灌洗液，離心取上清，根據BCA 蛋白測定試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的測定；按照ELISA 試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-6 和TNF-α含量。

2.6 肺組織TRPM6 和TRPM7 mRNA 表達水平測定 每組取5 只大鼠取部分左肺上葉組織，制成勻漿，采用Trizol 法提取總RNA，并進行RNA 的濃度和純度的測定，根據RNA 反轉錄試劑盒說明合成cDNA，TRPM6、TRPM7 和β-actin 引物由寶生物工程大連有限公司合成。TRPM6 上游引物為5'-CCACCAATACCCTGGAAGAA-3'，下游引物為5'-AGGAGTYGCAGCGATGTTTT-3'；TRPM7 上游引物為5'-TGGCATATGAAGCAAAGCAG-3'，下游引物為5'-CAAGGTGGACGGTATAACGA-3'；β-actin 上游引物為5'-GTTGGTTGGAGCAAACATCC-3'，下游引物為:5'-AAGCAATGCTGTCACCTYCC-3'；再根據熒光定量PCR 試劑盒說明，制備20μL 反應體系進行擴增，在CFX-96 PCR 擴增儀中進行擴增。反應條件為95℃預變性1min，95℃變性30s，58℃退火5s，共30個循環(huán)，72℃延伸5s。采集熒光，以β-actin 作為內參，采用2-ΔΔCt 法計算TRPM6 和TRPM7 mRNA的表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析實驗數據，計量資料采用均數±標準差（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 鼠尾草酚對大鼠PaO2、PaCO2和PaO2/FiO2的影響 與對照組比較，模型組和各鼠尾草酚劑量組大鼠PaO2和PaO2/FiO2降低，PaCO2升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各鼠尾草酚劑量組大鼠PaO2和PaO2/FiO2升高，PaCO2降低，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 鼠尾草酚對各組大鼠PaO2、PaCO2 和PaO2/FiO2影響（mmHg，）

表1 鼠尾草酚對各組大鼠PaO2、PaCO2 和PaO2/FiO2影響（mmHg，）

注:對照組和模型組均給予生理鹽水；鼠尾草酚低、中、高劑量組分別給予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混懸液；PaO2 為氧分壓；PaCO2 為二氧化碳分壓；PaO2/FiO2 為動脈血氧分壓/吸入氣氧濃度；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鼠尾草酚低劑量組比較，cP＜0.05；與鼠尾草酚中劑量組比較，dP＜0.05；1mmHg=0.133kPa

3.2 鼠尾草酚對大鼠肺組織形態(tài)學改變的影響 對照組肺泡結構清楚，無炎性細胞浸潤痕跡；模型組肺間室增大，肺間質炎癥細胞浸潤，肺間隔發(fā)生斷裂，肺毛細血管充血伴血外；各鼠尾草酚劑量組肺損傷程度較模型組明顯減輕，且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 鼠尾草酚對大鼠肺組織形態(tài)學改變的影響（HE 染色×200 倍）

3.3 鼠尾草酚對大鼠肺W/D、MPO 和SOD 的影響與對照組比較，模型組和各鼠尾草酚劑量組大鼠肺W/D 和MPO 升高，SOD 降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各鼠尾草酚劑量組大鼠肺W/D和MPO 降低，SOD 升高，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3.4 鼠尾草酚對大鼠肺支氣管肺泡灌洗液蛋白、IL-6 和TNF-α 含量的影響 與對照組比較，模型組和各鼠尾草酚劑量組大鼠肺支氣管肺泡灌洗液中蛋白、IL-6 和TNF-α 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各鼠尾草酚劑量組大鼠肺支氣管肺泡灌洗液中蛋白、IL-6 和TNF-α 含量降低，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 鼠尾草酚對大鼠肺W/D、MPO 和SOD 影響（）

表2 鼠尾草酚對大鼠肺W/D、MPO 和SOD 影響（）

注:對照組和模型組均給予生理鹽水；鼠尾草酚低、中、高劑量組分別給予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混懸液；W/D 為濕重/干重；MPO 為髓過氧化物酶；SOD 為超氧化物歧化酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鼠尾草酚低劑量組比較，cP＜0.05；與鼠尾草酚中劑量組比較，dP＜0.05

表3 鼠尾草酚對大鼠肺支氣管肺泡灌洗液蛋白、IL-6和TNF-α 含量影響（）

表3 鼠尾草酚對大鼠肺支氣管肺泡灌洗液蛋白、IL-6和TNF-α 含量影響（）

注:對照組和模型組均給予生理鹽水；鼠尾草酚低、中、高劑量組分別給予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混懸液；IL-6 為白細胞介素6；TNF-α為腫瘤壞死因子α；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鼠尾草酚低劑量組比較，cP＜0.05；與鼠尾草酚中劑量組比較，dP＜0.05

3.5 鼠尾草酚對大鼠肺組織TRPM6 和TRPM7 mRNA 表達水平的影響 與對照組比較，模型組和各鼠尾草酚劑量組大鼠肺組織TRPM6 和TRPM7 mRNA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各鼠尾草酚劑量組大鼠肺組織TRPM6 和TRPM7 mRNA 表達水平降低，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 鼠尾草酚對大鼠肺組織TRPM6 和TRPM7 mRNA表達水平影響（）

表4 鼠尾草酚對大鼠肺組織TRPM6 和TRPM7 mRNA表達水平影響（）

注:對照組和模型組均給予生理鹽水；鼠尾草酚低、中、高劑量組分別給予5、10、20mg/kg 鼠尾草酚混懸液；TRPM6 為轉化受體電位陽離子通道亞家族M 成員6；TRPM7 為轉化受體電位陽離子通道亞家族M成員7；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鼠尾草酚低劑量組比較，cP＜0.05；與鼠尾草酚中劑量組比較，dP＜0.05

4 討論

PaO2/FiO2通常用于急性缺氧性呼吸衰竭的診斷，是診斷ARDS 的重要指標[10]。本研究采用LPS 法建立膿毒癥大鼠肺損傷模型，結果顯示，模型組的PaO2和PaO2/FiO2降低，PaCO2、蛋白含量和W/D 升高，而在注射了鼠尾草酚后上述指標發(fā)生相反的變化。說明LPS 成功建立了膿毒癥大鼠肺損傷模型，而鼠尾草酚對膿毒癥大鼠肺水腫具有緩解作用。然而，鼠尾草酚治療膿毒癥所致肺損傷的機制尚未明確。

氧化應激參與膿毒癥的發(fā)病機制。作為一種溶酶體酶，MPO 在中性粒細胞中廣泛表達，主要功能是抵御微生物感染；同時，SOD 對清除活性氧至關重要，與超氧化物的損傷反應相互競爭，保護細胞免受超氧化物毒性的侵害，反映了機體清除活性氧、防止脂質氧化損傷的能力[11-12]。本研究結果顯示，與模型組組比較，注射鼠尾草酚后，MPO 活性下降，SOD 活性增加（P＜0.05）。失調性肺部炎癥是肺損傷中典型特征之一，因此，本研究對各種炎癥介質的作用進行了深入的評估，特別是TNF-α 和IL-6。由于促炎和抗炎特性的功能，TNF-α 和IL-6 具有激活多種疾病（例如克羅恩病，糖尿病和潰瘍性結腸炎）中的炎癥和自身免疫過程的能力[13]。本研究顯示，與模型組組比較，注射鼠尾草酚后TNF-α 和IL-6 表達降低（P＜0.05）。

TRPM6 和TRPM7 都屬于瞬時受體電位離子通道家族，這些離子通道是獨特的二價陽離子通道，對鎂離子（Mg2+）和鈣離子（Ca2+）具有通透性[14]。研究表明，TRPM6 具有調節(jié)腎臟對Mg2+的再吸收和腸道對Mg2+的吸收的能力，而TRPM7 具有調節(jié)細胞粘附活性的作用[15]。TRPM7 和TRPM6 形成一對獨特的通道。TRPM6 基因編碼區(qū)發(fā)生錯義突變，其特征是該蛋白的表達減少，從而降低Ca2+的吸收，也影響Mg2+的吸收，高Mg2+或低Mg2+水平會造成嚴重的肺部疾病[16]。本研究結果顯示，抑制TRPM6 和TRPM7 活性可以減輕膿毒癥大鼠肺損傷引起的炎癥反應。這證實了鼠尾草酚的作用及其通過降低TRPM6 和TRPM7 的表達來減輕膿毒癥誘導的肺損傷的潛力。

綜上所述，鼠尾草酚通過降低TRPM6 和TRPM7 的表達，減少炎癥介質分泌和增加抗氧化介質的水平，發(fā)揮膿毒癥大鼠的肺損傷的保護作用。