李 燕，楊建花，李寶庫，朱蕾蕾*

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室,天津 300308)

漆酶(Laccase, EC 1.10.3.2)是一種含有四個銅離子的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，能夠催化多種酚類和非酚類的化合物[1-3]，因此在造紙漂白[4-5]、染料脫色[6-7]、食品加工[8]、環(huán)境保護[9]等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。但是，自然界的野生菌漆酶存在酶活低、產(chǎn)量低、培養(yǎng)周期長、高溫易失活等問題，導(dǎo)致其難以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，通過定向進化技術(shù)來提高漆酶表達(dá)量、催化能力、穩(wěn)定性及底物特異性等；尋找合適的載體進行漆酶基因的異源表達(dá)來提高表達(dá)量，都是目前解決問題的有效方法[10-12]。

定向進化是一種在實驗室模擬達(dá)爾文進化的過程，通過對基因進行突變或重組，建立突變庫以篩選到性能更好的蛋白，是一種最有前途的提高漆酶表達(dá)和性能的方法[13]。釀酒酵母因其操作簡單，生產(chǎn)成本低，分泌表達(dá)易于純化，能對表達(dá)蛋白進行加工、修飾等諸多優(yōu)點脫穎而出，成為目前最主要的外源蛋白表達(dá)宿主之一[14]。此外，釀酒酵母因不產(chǎn)生毒素，安全性好，成為一種與人類生活密切相關(guān)的酵母, 廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域[15]。作為真核生物的模式菌, 釀酒酵母全序列的測定已于1996年完成，是目前了解最完全的真核生物[16]。因此，本章通過對漆酶Lcc轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域進行突變，并將pYES2-Lcc突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母進行異源表達(dá)，構(gòu)建釀酒酵母菌株突變庫，利用以ABTS為底物的酶活檢測篩選方法，篩選出高酶活、高表達(dá)量的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21Gold(DE3)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) INVSc1菌株由本實驗室保存，重組載體pYES2-Lcc由本實驗室構(gòu)建。

1.2 酶和試劑

Easy Taq?DNA Polymerase、10×Easy Taq?Buffer、2.5 mM dNTPs、基因Marker(Trans 15K DNA Marker)購自TransGen Biotech公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；酵母質(zhì)粒小提試劑盒、無氨基酵母氮源(YNB)購自Solarbio公司。胰蛋白胨Tryptone、酵母提取物Yeast Extract購自英國OXOID 公司；瓊脂糖Agar購自Sigma公司；2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)購自Coolaber公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

(1) YPAD培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，0.004%硫酸腺嘌呤，121℃滅菌15 min。

(2) SC-U培養(yǎng)基：0.67%無氨基酵母氮源，2%碳源(葡萄糖或棉子糖)，0.01% (腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸)，0.005% (天冬氨酸，組氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，酪氨酸，纈氨酸)，固體培養(yǎng)基添加2% Agar，121℃滅菌20 min。

(3) HC預(yù)培養(yǎng)基：10% 10×YNB，10% 10×HC dropout solution，20% 200 g/L galactose，10% 1 mol/L pH值6.2 KH2PO4-KOH緩沖液，50%去離子水。

(4) HC表達(dá)培養(yǎng)基：10% 10×YNB，10% 10×HC dropout solution，20% 200 g/L galactose，10% 1 mol/L pH值6.2 KH2PO4-KOH緩沖液，0.2% 0.25 mol/L，59.8%去離子水，過濾除菌。

1.4 Lcc轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列突變庫構(gòu)建

將實驗室保藏的大腸桿菌BL21/pYES2-Lcc劃線于LB (Amp)固體平板，挑取單克隆接種于LB (Amp)液體培養(yǎng)基，并于37℃、200 r/min的恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)。利用質(zhì)粒小提試劑盒提取pYES2-Lcc質(zhì)粒，作為易錯PCR的模板DNA，以fw-lcc-調(diào)節(jié)區(qū)域為上游引物，其堿基序列為5′-GTGGAAGCGGTATTCGCAATG-3′，rev-lcc-調(diào)節(jié)區(qū)域為下游引物，其堿基序列為5′-GAGCTCGGTACCAAGCTTAATATTCC-3′。反應(yīng)體系：Template DNA (50 ng/μL) 2 μL，10 μM Forward Primer 2 μL，10 μM Reverse Primer 2 μL，10×EasyTaq?Buffer 10 μL，2.5 mM dNTPs 8 μL，EasyTaq?DNA Polymerase 2 μL，10 mM Mn2+，ddH2O 71 μL，total 100 μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。每個小離心管裝25 μL，放入PCR儀，反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL產(chǎn)物利用1%核酸膠電泳檢測驗證，通過膠回收純化回收目的條帶，命名為Lcc-ep.并將其重組到質(zhì)粒上，取1 μL重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21Gold(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，電擊后加入1 mL LB液體培養(yǎng)基混勻，37℃、200 r/min搖床中孵育1 h，分別涂布于含有Amp的LB固體平板(Amp抗性篩選)，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。收集到的菌體用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，按其說明書操作。

1.5 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化

用LiAc/SS載體DNA/PEG法高效轉(zhuǎn)化冷凍活性酵母細(xì)胞，具體操作步驟如下：將配制好的ssDNA從-20℃冰箱取出，沸水中煮5 min，使其變性，取出后立即放入冰浴備用；將-80℃保藏的感受態(tài)細(xì)胞取出，放于37℃水中15～30 s，13000 r/min離心2 min，去除上清，依次加入下列：260 μL 50% (w/v) PEG 3350，36 μL1.0 mol/L LiAc，50 μL 2.0 mg/mL ssDNA，14 μL待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒(pYES2-Lcc-ep)及無菌水，360 μL總體積；用移液器充分混勻，放于42℃水浴20～60 min；13000 r/min離心30 s，去除上清；加入1 mL YPAD液體培養(yǎng)基重懸，放入30℃水浴2～3 h；取200 μL重懸液涂布于SC-U平板，30℃培養(yǎng)3～4天，即可長出轉(zhuǎn)化子。

1.6 重組釀酒酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及其篩選

表達(dá)：待SC-U平板長出轉(zhuǎn)化子后，用無菌牙簽隨機挑取轉(zhuǎn)化子接種到含150 μL的HC預(yù)培養(yǎng)基(含Amp，Kan)的96孔板(平底)中，封口，30℃，800 r/min搖床培養(yǎng)2天，并做空白、空質(zhì)粒、野生型對照；用復(fù)制器復(fù)制到含180 μL的HC表達(dá)培養(yǎng)基(含Amp，Kan)的96孔板(尖底)中，20℃，800 r/min搖床培養(yǎng)3天；剩余菌液加入50 μL 50%甘油，-80℃冰箱保存。

96孔板篩選：從表達(dá)好的重組釀酒酵母96孔板中，取出20 μL菌液到新的96孔板，再加入180 μL去離子水，用酶標(biāo)儀測波長600 nm下的吸光度；將96孔板剩余菌液4000 r/min，15 min離心，以ABTS為底物，以pH值3.0的檸檬酸為緩沖液，在420 nm下測定吸光度，按以下體系測酶活力：110 μL pH值3.0檸檬酸緩沖液，50 μL上清，40 μL ABTS (7 mM )。酶活力單位定義為：1 min內(nèi)催化氧化1 μmol底物的酶量為1個酶活單位。篩選到的酶活高于野生型的突變菌株挑選出來，再從原母板用無菌牙簽中蘸取菌液進行預(yù)培養(yǎng)基、表達(dá)培養(yǎng)，測OD600，測ABTS酶活力(步驟同上)；

搖瓶復(fù)篩：復(fù)篩到的高活性突變菌株從原母板取50 μL菌液接種到3 mL HC預(yù)培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)接到HC表達(dá)培養(yǎng)基(50 mL搖瓶/25mL培養(yǎng)基/250 μL菌液)，測OD600，收菌，測上清ABTS酶活力。

1.7 釀酒酵母高活性突變體序列測定

釀酒酵母高活性突變體抽提質(zhì)粒，按酵母質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作；以提取的釀酒酵母高活性突變體質(zhì)粒為模板做克隆PCR驗證(T7 promoter、T7 terminator商業(yè)引物做正反向引物)；驗證正確的突變體將提取的重組釀酒酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21Gold(DE3)感受態(tài)細(xì)胞；當(dāng)平板上生長出單菌落時，挑取單克隆并接種至LB (Amp)液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h；將培養(yǎng)的菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取大腸質(zhì)粒，測DNA濃度并進行質(zhì)粒驗證，然后送至公司進行測序，將測序正確的菌株甘油凍存管儲存在-80℃冰箱中。

1.8 漆酶高表達(dá)突變株調(diào)節(jié)區(qū)域序列比對

將測序結(jié)果進行整理，與原始序列進行同源比對，該過程用SnapGene軟件完成，統(tǒng)計堿基突變位點。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pYES2-Lcc質(zhì)粒為模板，fw-lcc-調(diào)節(jié)區(qū)域、rev-lcc-調(diào)節(jié)區(qū)域分別為上下游引物進行易錯PCR，克隆得到的產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，epPCR產(chǎn)物條帶約1000 bp，克隆產(chǎn)物條帶約為7602 bp，符合預(yù)期。該重組質(zhì)粒及其調(diào)節(jié)區(qū)域如圖2所示。

M代表Marker；1-2代表epPCR產(chǎn)物；3-4代表克隆產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒調(diào)節(jié)區(qū)域示意圖Fig.2 Schematic diagram of the regulatory gene sequence of recombinant plasmid

2.2 重組釀酒酵母的篩選

對挑取的突變子利用ABTS檢測方法進行初篩，以ABTS為底物測得酶活力高于野生型1.3倍的有46株。對46個優(yōu)勢菌株進行96孔板復(fù)篩，每個突變體設(shè)置4個平行樣，獲得13個優(yōu)勢突變體；最后對13個優(yōu)勢突變體進行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖3所示。其中，酶活是野性型酶活1.5倍以上的突變株有3株，1.29～1.5倍的突變株有7株，1.04～1.2倍的突變株有3株。突變體M1酶活最高，可達(dá)35.4 U/L。

圖3 野生型和13個優(yōu)勢突變體搖瓶復(fù)篩漆酶粗酶液酶活檢測結(jié)果Fig.3 Activity detection results of crude enzymes from the flask cultivation of wild type and 13 dominant mutants

2.3 突變體序列測定及比對

為測定13個優(yōu)勢突變體中酶活最高的3株菌株的堿基序列，首先抽提酵母質(zhì)粒，并對其進行克隆PCR，PCR產(chǎn)物驗證電泳圖如圖4所示。從圖中可以看到一條大小約為1500 bp的清晰條帶，說明酵母質(zhì)粒提取成功。之后將提取的重組釀酒酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21Gold(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，接種單克隆培養(yǎng)，并抽提質(zhì)粒，將質(zhì)粒送公司測序，然后用SnapGene軟件整理測序結(jié)果，與原序列比對后，發(fā)現(xiàn)活性最高的三個突變體在GAL1 promoter區(qū)域均有突變。因此推斷，3個突變體上出現(xiàn)的4個突變加強了啟動子與RNA聚合酶的結(jié)合，因此加速了漆酶基因的轉(zhuǎn)錄能力，從而引起漆酶表達(dá)量的提高。

M代表Marker，1-3代表M1、M2、M3突變體

3 結(jié)論與展望

本章通過對調(diào)節(jié)漆酶Lcc表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)域進行突變，并將pYES2-Lcc突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母進行異源表達(dá)，構(gòu)建釀酒酵母菌株突變庫，利用以ABTS為底物的高通量的篩選方法對突變庫進行篩選，并對酶活高的突變體進行搖瓶復(fù)篩，最終獲得了三株遺傳穩(wěn)定的高酶活突變體M1、M2、M3。它們的突變均在GAL1啟動子區(qū)域，說明啟動子上的突變引起了漆酶表達(dá)量的提高。通過定向進化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，漆酶最高活性可達(dá)35.4 U/L。