(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

藥用百合，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為百合科植物卷丹、百合或細葉百合的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]。江蘇宜興、湖南邵陽、甘肅蘭州和浙江湖州栽培百合歷史悠久，為全國“四大百合產(chǎn)區(qū)”[2]。百合配方顆粒由百合飲片在中醫(yī)藥理論指導下，利用現(xiàn)代制藥技術，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒和包裝等精制而成，其功能、主治、性味、歸經(jīng)與傳統(tǒng)百合飲片一致。由于配方顆粒缺少了傳統(tǒng)飲片賴以判別優(yōu)劣的外形、氣味等性狀特征，為保證其顆粒的質(zhì)量，規(guī)定通過特征圖譜的方式進行不同環(huán)節(jié)之間的鑒別。李敏等[3]對中藥白芍親緣性進行分析并對分子進行鑒定標記，為其他中藥材品種的分子水平的鑒定研究提供了參考。以藥材(飲片)、水煎劑、配方顆粒的相關性為基礎的特征圖譜研究可以準確地表達其特征的追溯性[4]。周永妍等[5]對獨腳金配方顆粒、水煎劑、飲片特征圖譜進行了比較研究，為全面控制獨腳金配方顆粒的質(zhì)量提供了方法；陳潔等[6]利用HPLC指紋圖譜結合主成分分析對不同產(chǎn)地頭頂一顆珠進行了質(zhì)量評價；孫福仁等[7]基于UPLC特征圖譜與主成分分析對白芷配方顆粒進行了質(zhì)量評價。郭秋平[8]對不同來源藥用百合及其總皂苷建立相關HPLC指紋圖譜，并綜合建立3 種不同來源藥用百合共同的特征圖譜，經(jīng)相似度比較，得出藥用百合總皂苷來源均一，質(zhì)量穩(wěn)定。蔡寶昌等[9]構建百合藥材低極性部位的GC/MS指紋圖譜，比較不同產(chǎn)地、不同品種百合中脂溶性成分的整體相似性，結果顯示藥用百合的整體相似度較食用百合高，且同一產(chǎn)區(qū)的樣品相似度較高。聚類分析指將物理或抽象對象的集合分組為由類似的對象組成的多個類的分析過程。王萬良等[10]研究的聚類算法基于ADAM拉普拉斯約束，有更高的聚類效果和更快的運行效率，綜合性能優(yōu)于相關的聚類方法。陸億紅等[11]研究的基于區(qū)間數(shù)的不確定數(shù)據(jù)流的聚類算法，具有良好的聚類效果，提高了不確定數(shù)據(jù)流聚類的聚類質(zhì)量和速率。

本研究采用HPLC法建立了百合配方顆粒的特征圖譜，并考察標準湯劑與飲片、中間體、配方顆粒之間的相關性，旨在用于百合配方顆粒生產(chǎn)過程各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，也可為中藥配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究提供參照。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國Agilent 科技有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent 科技有限公司)，電子天平(YP502N，上海菁海儀器有限公司)，萬分之一電子天平(BS124，賽多利斯科學儀器北京有限公司)，電子煎藥壺(FT-30系列，深圳市正云科技有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(R210+V700，瑞士Buchi公司)，德國eppendor小型離心機(Centrifuge mini)，PD-1D-50型冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-D，鞏義市予華儀器有限責任公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE，鞏義市予華儀器有限公司)，干法制粒機(GZL100-25L，石家莊科源機械設備有限公司)。

1.2 實驗材料

10 批百合飲片(表1)，10 批標準湯劑(自制)，10 批噴干粉(自制)，10 批配方顆粒(自制)。乙腈(色譜純，TEDIA)，甲酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，純水(杭州娃哈哈有限公司)。

表1 10 批百合飲片產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of 10 batches of Lily slices

2 實驗方法與結果

2.1 百合飲片供試品溶液的制備

取百合飲片粉末約1 g，加純水50 mL，加熱回流45 min(沸騰后計時)，取適量藥液離心，13 000 r/min離心5 min，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 百合標準湯劑的制備

采用電子煎藥壺煎煮，取百合飲片100 g，加8倍水浸泡30 min，加熱沸騰后先武火煎煮30 min，后改文火煎煮30 min，趁熱過120 目篩網(wǎng)，藥渣再加6倍水，加熱沸騰后武火煎煮30 min，趁熱過濾，合并兩次藥液，得400～600 mL，即百合標準湯劑。

2.3 百合配方顆粒的制備

按2.2項下制得的百合標準湯劑減壓濃縮，60～65 ℃，真空度-0.08 MPa，濃縮到相對密度(相對于純水)為1.05～1.08 (25 ℃)，以浸膏不粘壁，流動性好為宜，得清膏。清膏噴霧干燥，進風溫度180～185 ℃，出風溫度85～90 ℃，得浸膏粉(即中間體)。浸膏粉加適量輔料干法制粒。

2.4 色譜條件

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸水為流動相B，梯度洗脫按表2進行，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm。

表2 梯度表Table 2 Gradient table

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度考察

取百合標準湯劑1.5 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取同一份供試品溶液20 μL，依照上述色譜條件連續(xù)進樣6 次，結果見表3。結果表明：筆者方法共有峰的相對保留時間RSD均不大于0.06%，相對峰面積RSD均不大于0.75%，精密度良好。

表3 精密度考察結果(峰面積)Table 3 Precision test results (peak area)

2.5.2 重復性考察

取百合標準湯劑1.5 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，依照上述色譜條件進樣，結果見表4。結果表明：筆者方法共有峰的相對保留時間RSD均不大于0.09%，相對峰面積RSD除3號峰為7.13%外，均不大于1.32%，重現(xiàn)性良好。

表4 重復性考察結果(峰面積)Table 4 Repeated results (peak area)

2.5.3 穩(wěn)定性考察

取百合標準湯劑1.5 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，分別在0，2，4，8，12，24 h進樣，結果見表5。結果表明：筆者方法共有峰的相對峰面積RSD均不大于3.71%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性考察結果(峰面積)Table 5 Stability results (peak area)

2.6 百合標準湯劑、中間體、顆粒的特征圖譜

按照2.4項下的色譜條件，分別得到10 批百合標準湯劑、中間體、顆粒的特征圖譜，如圖1所示。

圖1 百合不同階段的特征圖譜Fig.1 Characteristic maps of Lily at different stages

2.7 色譜條件選擇

205，230，280，320，268 nm等多波長測試結果顯示280 nm下峰的信息量較多，峰型及分離度較好，因此選擇280 nm作為百合指紋圖譜的檢測波長。分別考察了0.8，1.0，1.2 mL/min 3 個流速對出峰時間和峰面積的影響，結果顯示：流速對特征峰的出峰時間和峰面積有影響，流速1.2 mL/min時各特征峰峰面積均較小，流速1.0 mL/min較流速0.8 mL/min特征峰出峰時間快，故選擇流速為1.0 mL/min。同時也考察不同儀器的耐用性，安捷倫1290 UHPLC、安捷倫1260 HPLC、安捷倫1290 UHPLC、安捷倫1260 HPLC在45 min內(nèi)均能完成各特征峰的分析，但安捷倫1290 UHPLC色譜圖中4號峰、5號峰峰面積較高，故選擇安捷倫1290 UHPLC進行百合標準湯劑特征圖譜分析較合適。

2.8 數(shù)據(jù)處理

2.8.1 10 批百合飲片的主成分分析

以5 個特征峰面積為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，SPSS 12.0為統(tǒng)計工具，進行主成分分析。結果發(fā)現(xiàn)第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的累積方差貢獻率可達98.02%，至第3主成分(PC3)的累積貢獻率達到99.57%，說明前3 個主成分基本包含了5 個峰變量的全部信息。其中，前兩個主成分得分最高的是峰1、峰2、峰4，說明這3 個峰對藥材質(zhì)量的影響最大。對PC1和PC2的得分向量作圖，結果見圖2，發(fā)現(xiàn)10批藥材都在一組，說明本研究中所用到的各個產(chǎn)地的百合藥材在主要化學成分上無較大區(qū)別，質(zhì)量均一。

圖2 百合飲片特征圖譜主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of the characteristic map of Lily pieces

2.8.2 特征圖譜的相關性分析

采集百合飲片、標準湯劑、中間體及配方顆粒的特征圖譜進行疊加比較分析，可觀察從原料到成品的化學成分變化，同時采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A版”進行相似度計算，以標準湯劑共有模式為參照圖譜，多點校正后進行Mark峰匹配。飲片、標準湯劑、中間體及配方顆粒的特征圖譜的疊加效果如圖3所示，可知百合飲片的5 個特征共有峰在標準湯劑、中間體、顆粒的色譜圖中均可找到對應峰，說明配方顆粒的主要化學成分可追溯。

圖3 特征圖譜疊加圖Fig.3 Characteristic atlas overlay map

3 結 論

筆者采用特征圖譜技術結合主成分分析，對10 批不同產(chǎn)地的百合飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒進行了分析和評價。配方顆粒沒有傳統(tǒng)飲片賴以判別優(yōu)劣的外形、氣味等性狀特征，無法通過傳統(tǒng)方法判別優(yōu)劣，本研究可以一定程度上確保其與傳統(tǒng)飲片水煎劑的一致性。同時，筆者建立的特征圖譜方法適用于百合配方顆粒的整個生產(chǎn)流程，為百合配方顆粒的質(zhì)量控制提供了參考。研究表明：所擬定的百合配方顆粒特征圖譜與百合飲片、標準湯劑特征圖譜相似性高、化學成分基本一致，說明藥材、標準湯劑和配方顆粒之間的化學成分可追溯，可用于百合配方顆粒的質(zhì)量控制，也可用于生產(chǎn)過程各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。