王 麗，段翠密，原芳芳，王 燕，郭希民，郭紅延

骨折或者骨缺損愈合需要較漫長(zhǎng)的鈣化和改建過(guò)程，給患者帶來(lái)巨大痛苦，降低患者生活質(zhì)量，加速骨折愈合成為中外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)來(lái)源的外泌體是一種納米級(jí)囊泡樣小體，直徑為40～100 nm，并含有大量的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)特異性蛋白、脂質(zhì)、mRNA和miRNA等生物活性物質(zhì)，參與細(xì)胞及內(nèi)環(huán)境之間的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞[1]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化[2]，然而骨髓MSC的提取過(guò)程復(fù)雜，具有侵入性，感染概率高，不利于外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，從產(chǎn)后廢棄組織中提取干細(xì)胞成為首選[3]，hucMSCs來(lái)源豐富、免疫原性低、無(wú)倫理道德?tīng)?zhēng)議、倍增時(shí)間短、擴(kuò)增能力強(qiáng)，便于進(jìn)行商品化生產(chǎn)。

在對(duì)hucMSC-exo的研究中發(fā)現(xiàn)其具備hucMSC的大部分優(yōu)勢(shì)且無(wú)致瘤[4]。目前，還沒(méi)有關(guān)于hucMSC-Exos對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為影響的報(bào)道。因此，本研究從細(xì)胞條件培養(yǎng)液中提取并鑒定hucMSC-exo，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察hucMSC-exo對(duì)mOPCs增殖與分化的影響，以期為未來(lái)hucMSC-exo在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 胎牛血清、α-MEM(Gibco，美國(guó))；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher，美國(guó))；地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉、油紅干粉(Sigma，美國(guó))；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Cyagen，中國(guó))；堿性磷酸酶染色試劑盒(上海邁基，中國(guó))；CCK-8(同仁，日本)；Anti-CD9抗體(Millipore，美國(guó))；Anti-CD63抗體(Affinity Biosciences，美國(guó))；超速離心機(jī)(Beckman Optima TM L-100XP，美國(guó))；電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；倒置顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新生24 h內(nèi)C57BL/6乳鼠及3周齡C57BL/6小鼠(SPF級(jí))，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 方法

1.3.1 mOPCs的分離培養(yǎng) 按照貼壁法分離培養(yǎng)原代mOPCs[5]。將健康新生24 h內(nèi)的C57BL/6乳鼠浸泡于75%乙醇中，進(jìn)行皮膚消毒，5 min后取出，脫頸處死，無(wú)菌條件下取出小鼠顱骨，去除其周?chē)M織并盡可能地剪碎，加入0.25%的胰酶及0.1%的膠原酶消化20 min后，用等量的完全培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min，離心5 min后，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液吹散，將碎骨片鋪于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5～7 d，于第3天更換培養(yǎng)液，之后隔天更換培養(yǎng)液，全程避免骨片移位，待細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時(shí)傳代，并進(jìn)行傳代穩(wěn)定性觀察。

1.3.2 hucMSCs的體外分離培養(yǎng)與鑒定 人臍帶來(lái)源于解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，產(chǎn)婦及家屬知情同意。按照Koh等[6]方法提取hucMSC，即無(wú)菌留取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)臍帶，生理鹽水洗凈，用青霉素、鏈霉素雙抗浸泡，去包膜、臍動(dòng)脈、臍靜脈，將華通氏膠剪碎，貼壁培養(yǎng)，待大部分細(xì)胞爬出，瓶底長(zhǎng)滿細(xì)胞，進(jìn)行換液、傳代，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。取第3代hucMSCs以1×105細(xì)胞/孔接種于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液的6孔板中，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，分別進(jìn)行成骨、成脂及成軟骨誘導(dǎo)。(1)hucMSCs的體外成骨分化及鑒定：細(xì)胞融合至60%時(shí)，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含有10%FBS，0.1 μM地塞米松，10 mMβ-甘油磷酸酯和50 μg/ml抗壞血酸的α-MEM培養(yǎng)液)，間隔3 d換液一次。14 d后，將細(xì)胞固定，馮·科薩染色觀察。(2)hucMSCs的體外成脂分化及鑒定：細(xì)胞融合至60%時(shí)，改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含有1 μM地塞米松，0.5 mM 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤，100 μM吲哚美辛和10 μM胰島素的α-MEM培養(yǎng)液)，14 d后，進(jìn)行油紅O染色評(píng)估。(3)hucMSCs的體外成軟骨分化及鑒定：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4到9代hucMSCs，傳代后取2×105個(gè)細(xì)胞在15 ml離心管內(nèi)以800 r/min離心5 min，細(xì)胞會(huì)在離心管底部形成小球，輕柔地吸掉上清液，換用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(以α-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加6.25 μg/ml胰島素、6.25 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10 ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/ml維生素C、5%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)，間隔3 d換液1次，21 d后將細(xì)胞固定，石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色以及免疫組化法測(cè)定軟骨組織特異性Ⅱ型膠原。

1.3.3 hucMSC-exo的分離與鑒定 按照Z(yǔ)hang等[7]所述方法提取外泌體，即取3～8代融合至80%的hucMSCs，以不含血清的α-MEM培養(yǎng)液饑餓處理，48 h后收集上清，1000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收集上清并通過(guò)0.22 μm的濾膜過(guò)濾以去除大于220 nm的囊泡顆粒。于4 ℃環(huán)境下，34 288 r/min離心80 min收集外泌體并儲(chǔ)存于-80℃，備用。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Scientific)測(cè)定外泌體蛋白含量。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM，HITACHI，H-7650)觀察外泌體的形態(tài)。RIPA裂解液裂解hucMSC-exo通過(guò)Western blot鑒定外泌體特征性標(biāo)志物CD9和CD63。

1.3.4 mOPCs增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組 對(duì)照組為mOPCs培養(yǎng)于5%FBS的α-MEM培養(yǎng)液；5 μg/ml hucMSC-exo實(shí)驗(yàn)組為mOPCs培養(yǎng)于含有5 μg/ml的外泌體、5%FBS的α-MEM培養(yǎng)液；10 μg/ml hucMSC-exo實(shí)驗(yàn)組為mOPCs培養(yǎng)于含有10 μg/ml的外泌體、5%FBS的α-MEM培養(yǎng)液。將P2代mOPCs以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，每組4個(gè)復(fù)孔，加入各組相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)，間隔2 d換液，分別于1、3、5、7 d經(jīng)CCK-8試劑盒測(cè)定450 nm處吸光度值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 堿性磷酸酶活性測(cè)定 將mOPCs以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，分組同上，每組3個(gè)復(fù)孔，加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)7 d，棄上清，PBS洗滌3次，按照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，利用IMAGE J軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3.6 茜素紅染色 將mOPCs以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于12孔板，分組同上，每組3個(gè)復(fù)孔，加入各組相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)21 d，各組細(xì)胞用4%多聚甲醛液固定10 min后，PBS洗滌3次，茜素紅染色30 min，蒸餾水清洗，觀察拍照。加入10%氯化十六烷基吡啶溶解1 h，吸取懸液，測(cè)562 nm處A值。

2 結(jié) 果

2.1 mOPCs的分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)mOPCs，骨片貼壁48 h后有大量細(xì)胞從骨片爬出，體積較小，胞體飽滿，突起較短，細(xì)胞增殖較快，細(xì)胞匯合后傳代培養(yǎng)(圖1A)。傳代后細(xì)胞以梭形為主，細(xì)胞呈半透明狀，輪廓清晰，旋渦狀生長(zhǎng)(圖1B和圖1C)。

圖1 mOPCs的分離培養(yǎng)(100×)

2.2 hucMSCs體外分離培養(yǎng)和鑒定 原代hucMSCs體外培養(yǎng)7 d，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁呈梭形，半透明狀，輪廓清晰，部分聚集成簇，呈旋渦狀生長(zhǎng)(圖2A)。多向分化結(jié)果顯示，hucMSCs體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d時(shí)，馮·科薩染色顯示礦化結(jié)節(jié)形成(圖2B)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后，油紅O染色見(jiàn)胞漿中出現(xiàn)圓形或橢圓形紅色串珠狀脂滴(圖2C)。成軟骨分化21 d后，HE染色可見(jiàn)組織團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞分布較均勻，細(xì)胞外基質(zhì)較為豐富(圖2D)，阿爾辛藍(lán)染色可見(jiàn)淡藍(lán)色的軟骨基質(zhì)成分(圖2E)，免疫組化染色顯示細(xì)胞外基質(zhì)中可見(jiàn)彌漫分布的Ⅱ型膠原(圖2F)。

圖2 hucMSCs分離培養(yǎng)與鑒定

A. hucMSCs原代培養(yǎng)；B. 馮·科薩染色；C. 油紅O染色；D. HE染色；E. 阿爾辛藍(lán)染色；F. Ⅱ型膠原染色

2.3 hucMSC-exo的分離與鑒定結(jié)果 透射電鏡下可見(jiàn)外泌體呈橢圓形、圓形，膜結(jié)構(gòu)完整，對(duì)3個(gè)樣品的多個(gè)視野進(jìn)行粒徑分析顯示，粒徑大小為(80.0±32.5)nm(圖3A)。Western blot的分析結(jié)果顯示外泌體的特征性標(biāo)志物CD9和CD63陽(yáng)性表達(dá)(圖3B)，符合文獻(xiàn)[8]報(bào)道的外泌體的生物學(xué)特性和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明成功分離獲得了hucMSC-exo。

圖3 hucMSCs-exo的鑒定

2.4 hucMSC-exo促進(jìn)mOPCs增殖 CCK8結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，在3、5、7 d時(shí)，添加hucMSC-exo(5 μg/ml，10 μg/ml)的實(shí)驗(yàn)組其mOPCs的增殖數(shù)量明顯增加，且隨著外泌體濃度的增高，增殖越明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖4)。

2.5 hucMSC-exo促進(jìn)mOPCs的成骨分化 堿性磷酸酶活性染色結(jié)果顯示，mOPCs培養(yǎng)7 d后，鏡下觀察可見(jiàn)添加hucMSC-exo實(shí)驗(yàn)組會(huì)有大量棕色硫化鈷顆粒沉積于胞質(zhì)中(圖5)，堿性磷酸酶活性顯著高于空白對(duì)照組，且酶的此種活性效應(yīng)隨著外泌體濃度的增加而增大，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。IMAGE J軟件半定量分析結(jié)果顯示，5 μg/ml和10 μg/ml hucMSC-exo實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

圖4 hucMSC-exo對(duì)mOPCs增殖的影響

圖5 hucMSC-exo刺激mOPCs后ALP染色(400×)

組別nALP半定量分析結(jié)果Control1224.61±1.925 μg/ml hucMSC-exo1252.35±3.97①10 μg/ml hucMSC-exo12108.32±3.69①②P0.05

注：與Control組相比，①P<0.05；與5 μg/ml hucMSC-exo組相比，②P<0.05

茜素紅染色結(jié)果顯示(圖6)，mOPCs培養(yǎng)21 d后，鏡下觀察可見(jiàn)添加hucMSC-exo實(shí)驗(yàn)組能夠分泌出更多的礦化基質(zhì)，有大量的鈣化結(jié)節(jié)形成，空白對(duì)照組則形成較少，茜素紅染色定量結(jié)果顯示空白對(duì)照組A562為0.324，5 μg/ml和10 μg/ml的hucMSC-exo實(shí)驗(yàn)組A562分別為1.352和1.87，均高于對(duì)照組，且此種鈣化結(jié)節(jié)的形成隨著外泌體濃度的增加而增大，亦表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

圖6 hucMSC-exo刺激mOPCs后茜素紅染色結(jié)果(100×)

3 討 論

據(jù)報(bào)道，MSC療法可促進(jìn)骨再生和骨折愈合[9, 10]。以往的研究證明，MSC療法在損傷修復(fù)過(guò)程中可以觸發(fā)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及信號(hào)分子之間的相互作用。但是，迄今為止尚未完全闡明這種作用的發(fā)生機(jī)制。在眾多潛在的分子機(jī)制中，MSC釋放的外泌體被認(rèn)為是至關(guān)重要的，并引起了越來(lái)越多的關(guān)注[11, 12]。Narayanan等[13]發(fā)現(xiàn)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體可觸發(fā)未分化的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化，Qin等[14]經(jīng)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究證明BMSC衍生的外泌體可以通過(guò)增強(qiáng)成骨基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控成骨細(xì)胞分化。與眾多的MSC相比，hucMSCs來(lái)源于產(chǎn)后廢棄組織，來(lái)源廣泛，無(wú)倫理道德?tīng)?zhēng)議，分離方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、增殖快，易于大規(guī)模生產(chǎn)，Todeschi等[15]研究發(fā)現(xiàn)hucMSCs的骨修復(fù)作用與干細(xì)胞通過(guò)旁分泌作用調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能有關(guān)，但他們無(wú)法證實(shí)外源性干細(xì)胞與內(nèi)源性祖細(xì)胞之間是否發(fā)生了細(xì)胞間串?dāng)_。我們目前的研究提供了第一個(gè)有力的證據(jù)，表明外源性干細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生外泌體與mOPCs進(jìn)行對(duì)話，并對(duì)其生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)低溫超速離心法獲得較純的外泌體，電鏡下呈杯托狀，大小多集中在90 nm處，并且能表達(dá)CD9和CD63標(biāo)志性表面蛋白，符合外泌體的生物學(xué)特性和鑒定標(biāo)準(zhǔn)[16]。將hucMSC-exo與mOPCs復(fù)合培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示hucMSC-exo可以明顯促進(jìn)mOPCs的增殖，且此種增殖效應(yīng)隨著時(shí)間和劑量的增加而增加，表現(xiàn)出顯著的時(shí)間依賴性和劑量依賴性。堿性磷酸酶活性水平是mOPCs早期成骨分化的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]，在hucMSC-exo刺激下培養(yǎng)7 d，mOPCs表現(xiàn)出更高的堿性磷酸酶活性。分化成熟的mOPCs會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)，是mOPCs成熟期成骨分化的重要指標(biāo)之一，在hucMSC-exo刺激下mOPCs培養(yǎng)21 d，可見(jiàn)更多的鈣結(jié)節(jié)形成，且隨著劑量增大而增加，亦表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從體外驗(yàn)證了hucMSC-exo可以促進(jìn)mOPCs的增殖以及提高其成骨分化能力，提示在未來(lái)研究中可考慮直接使用hucMSC-exo進(jìn)行骨損傷治療，以期取代間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)“無(wú)細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)”[18]，但目前，對(duì)干細(xì)胞源外泌體的研究仍處于臨床前期，有諸多問(wèn)題阻礙其臨床應(yīng)用，有待深入闡明，例如，如何大量富集、純化、標(biāo)記外泌體，如何根據(jù)外泌體半衰期制定合適的給藥途徑及給藥頻次，如何提高治療靶向性等[19, 20]。此外，hucMSC-exo中含有miRNA、mRNA、IncRNA及蛋白質(zhì)等多種生物活性分子，其作用很可能與這些生物活性分子有關(guān)，但具體由哪一種或者由哪幾種活性物質(zhì)，以何種方式起作用尚不清楚，在未來(lái)研究中還需進(jìn)一步闡明。