蘆宇婷，李 軍，周仙杰，呂裕霞，魯飛翔，劉慶春

機(jī)體骨骼肌隨著疾病、衰老等因素發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的衰退，使骨骼肌持續(xù)流失，通常表現(xiàn)為肌肉在運(yùn)動乃至日常行為中無法保持正常的力量水平，引起機(jī)體生物調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致機(jī)體疲勞感增強(qiáng)等問題[1，2]。營養(yǎng)干預(yù)是預(yù)防肌肉衰退、提升抗疲勞性的重要手段之一，因此，發(fā)掘能夠增強(qiáng)肌肉功能、抗疲勞的營養(yǎng)物質(zhì)尤為重要[3]。鞣花酸(ellagic acid，EA)是植物中存在的一種天然多酚化合物，經(jīng)腸道微生物代謝產(chǎn)生尿石素，通過被動擴(kuò)散的吸收機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4-7]。作為一種植物性天然化合物，EA藥理活性豐富[8-12]，有研究表明，健康志愿者通過補(bǔ)充富含EA的石榴汁使得力量恢復(fù)能力得以提升，減輕了運(yùn)動引起的肌肉酸痛[13，14]，因此，研究EA對肌肉功能的影響具有實際意義。但目前EA對機(jī)體肌功能及抗疲勞等方面的研究尚少，仍需進(jìn)一步研究。

本研究旨在通過對小鼠肌肉量、肌力、疲勞掉落次數(shù)，肌纖維橫截面積大小及與蛋白質(zhì)降解相關(guān)的基因肌肉特異性環(huán)指蛋白1(muscle RING finger 1，MuRF1)和肌肉萎縮基因Fbox-1(muscle atrophy f-box，MAFbx/Atrogin-1)相對表達(dá)量的檢測[15]，探討EA對正常小鼠體成分、肌肉功能、運(yùn)動耐力，以及抗疲勞性等方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 16只6周齡雄性清潔級ICR小鼠，體重(30.7±2.9) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于災(zāi)害救援基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中心。按照國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類試驗動物飼養(yǎng)，在(23±2)℃恒定室溫、12 h明暗交替環(huán)境下，實驗動物自由飲水、攝食。動物實驗經(jīng)動物福利委員會審批。

1.2 實驗動物EA干預(yù) 實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行簡單隨機(jī)分組，實驗組和對照組，每組各8只。精準(zhǔn)稱量體重后，利用Echo MRITM小動物體成分分析儀(中國匯佳生物股份有限公司)檢測體實驗動物成分。檢測結(jié)束當(dāng)天，給予實驗組動物純度99.3%的EA(南京道斯夫生物科技有限公司)，用0.5%的羥甲基纖維素鈉(北京索萊寶科技有限公司)溶液配制EA干預(yù)溶液，每毫升EA干預(yù)溶液中含10 mg EA，實驗組和對照組小鼠分別給予EA溶液和等體積的0.5%羥甲基纖維素鈉溶液進(jìn)行灌胃干預(yù)。參考以往試驗劑量[16]，EA灌胃劑量為10 mg/100 g體重，灌胃體積為1 ml/100 g體重，1次/d，干預(yù)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實驗動物體成分檢測 實驗動物稱重后，放置于相應(yīng)規(guī)格的透明塑料動物倉中，將動物倉插入Echo MRITM分析儀內(nèi)，設(shè)置精度3，即6次信號采集，通過掃描得到小鼠的肌肉含量。EA干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束12 h后各進(jìn)行一次檢測。

1.4 小鼠四肢肌力測定 用YLS-13A大小鼠抓力儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)測定小鼠四肢肌力，測定抓力前讓小鼠在抓力儀上適應(yīng)3 min，將抓力儀設(shè)置為測定狀態(tài)，確定小鼠四只腳掌都完全抓牢后，抓住小鼠尾巴末梢平穩(wěn)向后拉動，記錄抓力儀讀數(shù)。每只小鼠測定3次抓力(g)，取3次抓力平均值作為評估肌力的指標(biāo)，EA干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束12 h后各進(jìn)行一次檢測。

1.5 小鼠肌肉功能測定 用YLS-4C輪轉(zhuǎn)式疲勞儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)測定小鼠肌肉功能，預(yù)實驗摸索出YLS-4C輪轉(zhuǎn)式疲勞儀最佳輪轉(zhuǎn)速度和時間，儀器啟動前將小鼠置于滾輪上，啟動儀器，設(shè)置輪轉(zhuǎn)式疲勞儀轉(zhuǎn)速為35 r/min，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，使小鼠適應(yīng)1 min，開始計時，10 min計為一周期，每個周期結(jié)束后休息1 min，記錄小鼠在10 min內(nèi)的掉落次數(shù)，重復(fù)3次[17]。EA干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束12 h后各進(jìn)行一次檢測。

1.6 HE染色測定腓腸肌橫截面積 干預(yù)結(jié)束后，分離小鼠后腿兩側(cè)腓腸肌。將腓腸肌浸入10%甲醛固定液(北京索萊寶科技有限公司)中固定用于制作石蠟切片。HE染色后，應(yīng)用LEICA圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行圖像采集。每個圖像選取10個肌纖維，利用Image J軟件計算各個肌纖維橫截面積。

1.7 qRT-PCR檢測實驗動物腓腸肌中MuRF1基因表達(dá) 小鼠單側(cè)腓腸肌放入RNase-Free管中加液氮充分研磨，根據(jù)組織總RNA提取試劑盒說明進(jìn)行總RNA提取。利用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop微量分光光度計評估RNA的完整性和純度。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在逆轉(zhuǎn)錄過程中將RNA濃度調(diào)整一致(100 ng/20 μl)。構(gòu)建25 μl qRT-PCR反應(yīng)體系，采用以下條件進(jìn)行qRT-PCR實驗：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 20 s、58 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s條件下35個循環(huán)，72 ℃總延伸2 min。引物序列參照以往文獻(xiàn)[15]，其中GAPDH為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)置3個平行組。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠干預(yù)前后體重和體成分比較 EA干預(yù)前，兩組小鼠體重和體成分(肌肉含量、脂肪含量)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)后兩組間小鼠體重和體成分也未觀察到統(tǒng)計學(xué)差異，與之前報道的結(jié)果相似[3， 18]。由此可見，EA對小鼠體重和體成分無明顯影響(表1)。

觀察指標(biāo)例數(shù)實驗前實驗后P體重 對照組830.03±3.1333.58±4.020.425 實驗組831.29±2.9335.15±3.63脂肪含量 對照組82.53±0.943.38±0.990.393 實驗組82.24±0.442.91±1.11肌肉質(zhì)量 對照組822.49±3.0724.31±3.450.534 實驗組823.99±2.1425.28±2.56

2.2 小鼠干預(yù)前后四肢抓力和肌肉功能比較 EA干預(yù)前，兩組小鼠抓力無統(tǒng)計學(xué)差異。干預(yù)結(jié)束后，與對照組相比，實驗組小鼠抓力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。實驗開始前，兩組小鼠30 min輪轉(zhuǎn)疲勞儀掉落次數(shù)沒有差異。EA干預(yù)后，與對照組相比，實驗組掉落次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表2)。

時間對照組(n=8)實驗組(n=8)四肢抓力 實驗前229.63±30.76239.64±26.95 實驗后246.13±31.99336.00±38.33①掉落次數(shù) 實驗前3.00±0.763.13±0.64 實驗后3.25±0.711.75±0.46①

注：與對照組比較，①P<0.001

2.3 小鼠干預(yù)后腓腸肌肌纖維橫截面積比較 干預(yù)后，實驗組腓腸肌肌纖維排列較對照組更加緊密(圖1)。實驗組肌纖維橫截面積為(1248.96±103.57)μm2，對照組為(1167.43±82.53)μm2，與對照組相比，實驗組小鼠橫截面積增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A.對照組；B.實驗組

2.4 小鼠干預(yù)后腓腸肌中MuRF1和Atrogin-1基因的相對表達(dá)量比較 實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示，實驗組MuRF1和Atrogin-1基因的相對表達(dá)量(0.99±0.15、0.96±0.16)(1.48±0.39、1.45±0.09)均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

骨骼肌是人體非常重要的肌群，多種疾病的發(fā)生都伴隨著骨骼肌質(zhì)量的流失和功能的退化[19]。肌肉量降低導(dǎo)致肌肉功能受損，對老年人而言會使其活動能力下降，并伴隨著多種慢性病的發(fā)生，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致平衡障礙、起坐困難、跌倒骨折等意外風(fēng)險，嚴(yán)重影響了老年人生存質(zhì)量。對于中等及以上體力勞動的成人而言，肌肉質(zhì)量減少會引起疲憊乏力、免疫功能下降、記憶力衰退、睡眠質(zhì)量不佳等多方面危害，影響了日常生活和工作效率[3]。有研究表明[20]，萎縮或者廢用的肌肉可以在不同輔助治療后得以再生，輔助性營養(yǎng)治療可以減輕肌肉損傷、增強(qiáng)肌功能以及緩解疲勞[21]。

本實驗通過給予小鼠EA干預(yù)，研究其對小鼠肌肉功能的影響。結(jié)果顯示，EA干預(yù)后，小鼠的抓力增加和疲勞儀掉落次數(shù)減少，同時小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積增加。其中實驗組小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積增加，可能原因：一是腓腸肌以Ⅱ型肌纖維為主[22]，本實驗條件下EA的干預(yù)可能導(dǎo)致Ⅱ型肌纖維變大，使肌纖維橫截面積增加。Ⅱ型肌纖維與肌肉力量相關(guān)，本實驗中EA干預(yù)后實驗組小鼠抓力增強(qiáng)，便驗證了這種可能性。二是腓腸肌雖然以Ⅱ型肌纖維為主，但也含有Ⅰ型肌纖維，且小鼠Ⅰ型肌纖維較Ⅱ型肌纖維粗。在特定條件下，Ⅰ型肌纖維會向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化[23]，當(dāng)Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化速度降低時，可能也會出現(xiàn)肌纖維橫截面積增加的情況，這與本研究EA干預(yù)后實驗組小鼠肌纖維橫截面積大于對照組的結(jié)果相一致。Ⅰ型肌纖維與肌肉的耐力和抗疲勞性呈正相關(guān)[22]，與正常速度轉(zhuǎn)化的對照組比較，實驗組Ⅰ型肌纖維在肌肉中的比例相對較大，我們猜測EA干預(yù)后Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化速度降低，本實驗中實驗組小鼠掉落次數(shù)降低，即實驗組小鼠抗疲勞性和耐力更好。

此外， MuRF1和Atrogin-1基因在mRNA水平表達(dá)明顯上調(diào)，常作為骨骼肌萎縮早期的分子標(biāo)記物，本研究對腓腸肌中MuRF1和Atrogin-1基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果顯示，EA干預(yù)后，實驗組小鼠MuRF1和Atrogin-1基因的相對表達(dá)量降低。這表明本實驗條件下EA的干預(yù)對小鼠肌肉的代謝可能具有有益作用。

綜上所述，在行為學(xué)水平上，EA可以增加小鼠肌力，提升小鼠耐力及抗疲勞性；在組織病理學(xué)水平上，EA的干預(yù)可以增加肌纖維橫截面積；在基因水平上，EA干預(yù)可能通過泛素蛋白酶途徑，下調(diào)控制肌肉代謝的MuRF1和Atrogin-1的基因表達(dá)水平，緩解肌肉分解代謝，進(jìn)而改善肌肉功能。未來我們將研究重心放在臨床，進(jìn)一步探究EA對不同人群肌肉質(zhì)量、肌力以及肌肉功能等方面的影響，為以EA為主要原料的功能性食品的研發(fā)以及肌肉代謝疾病的預(yù)防與治療提供基礎(chǔ)研究及臨床試驗依據(jù)。