萬 慶，孫 松，許紅葉

(1 銅陵市食品藥品檢驗中心，安徽 銅陵 244000；2 合肥遠志醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，安徽 合肥 230088)

碳酸鈣D3顆粒為復方鈣補充劑，主要功效為補充人體的鈣含量，處方中含有維生素D3，可以促進鈣元素在體內(nèi)的吸收。目前關于維生素D3含量測定方法主要有皂化法[1-3]、提取后氮氣吹干復溶法[4-6]，但均存在操作困難及準確性差的問題，本文建立的維生素D3的檢測方法操作簡易且準確性高，為碳酸鈣D3顆粒中維生素D3的含量測定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

AB135-S十萬分之一天平，METTLER TOLEDO；島津LC-10AD液相色譜儀，蘇州島津公司；Sepax HP-Amino柱(4.6×250 mm，5 μm)；SK1200H超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；TDL-80-2B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試 藥

正己烷、異丙醇為色譜級，二甲亞砜、2,6-二叔丁基對甲酚為分析級，水為屈臣氏純凈水；維生素D3對照品(批號：100061-201208，純度99.8%)，中國食品藥品檢定研究院；碳酸鈣D3顆粒(生產(chǎn)批號：20180306、20180307、20180308)，北京康遠制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Sepax HP-Amino(250×4.6 mm,5 μm)色譜柱；以正己烷-異丙醇(99:1)為流動相；檢測波長:265 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL·min-1；進樣量：500 μL。在上述色譜條件下，維生素D3的理論塔板數(shù)為15012.361，對稱因子為1.102。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備溶液的制備

精密稱取維生素D3對照品25.23 mg，加入0.02% 2,6-二叔丁基對甲酚的正己烷溶液25 mL，混勻，作為對照品貯存液1#，精密量取對照品貯存液1#1 mL加0.02% 2,6-二叔丁基對甲酚的正己烷溶液20 mL，混勻，作為對照品貯存液2#。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品25袋內(nèi)容物，精密稱定，計算每袋平均裝量，研細，精密稱取細粉適量(約相當于維生素D3 25 μg)，置100 mL棕色量瓶中，加溶液[用二甲基亞砜-水(10:2)混合溶液制成每1 mL中含2,6-二叔丁基對甲酚(Butylated hydroxytoluene; BHT)0.2 mg的溶液] 50 mL，超聲振蕩15 min，并時時振搖，保持超聲水浴溫度不超過30 ℃，精密加0.02% 2，6-二叔丁基對甲酚的正己烷溶液25 mL，振搖15 min后，離心5 min(4000 rpm)，分取上層溶液，避光靜置1 h后得澄清溶液，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

取碳酸鈣D3顆粒，按“2.2.2”項方法制得系統(tǒng)適用性溶液，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖(見圖1)。

圖1 系統(tǒng)適用性實驗色譜圖

2.4 專屬性實驗

按碳酸鈣D3顆粒處方制備不含維生素D3的陰性空白樣品，按“2.2.2”項方法制得陰性對照溶液，用于方法的基質(zhì)干擾實驗。分別對維生素D3對照品、供試品溶液及陰性對照溶液進樣分析，考察樣品處方中輔料對維生素D3色譜峰是否有干擾。結果：樣品中輔料對維生素D3色譜峰無干擾。為進一步考察方法的專屬性，將碳酸鈣D3顆粒樣品分別進行高溫、光照、酸化、堿化和氧化條件下進行了強制性的降解實驗，以排除各條件下的降解產(chǎn)物對維生素D3色譜峰的干擾。精密稱取碳酸鈣D3顆粒10 g，按“2.2.2”項方法制得供試品溶液，取上述供試品溶液3 mL于80 ℃水浴中加熱6 h，冷卻值室溫，作為供試品溶液。取上述供試品溶液3 mL，加入100 μL 30% H2O2溶液，放置6 h后，作為供試品溶液。取上述供試品溶液3 mL加入50 μL三氟乙酸，放置5 min后，加入50 μL二乙胺中和至中性，作為供試品溶液。取上述供試品溶液3 mL加入100 μL二乙胺，放置8 h后，加入100 μL三氟乙酸中和至中性，作為供試品溶液。將各條件下供試品溶液注入高效液相色譜儀中。結果維生素D3在酸化時峰面積下降，說明有降解發(fā)生，不穩(wěn)定，其余條件峰面積基本無變化(見圖2)。

圖2 專屬性實驗(A-H)

2.5 線性關系考察

精密量取對照品貯存液2# 2 mL，加入0.02% 2,6-二叔丁基對甲酚的正己烷溶液50 mL，即得對照品貯存液3#。分別精密量取對照品貯存液3# 2、4、5、6、8 mL，分別置10 mL量瓶中定容，搖勻，作為各對照品溶液。取各濃度的對照品溶液，依次由低濃度至高濃度注樣，各濃度平行注樣2針，取峰面積平均值。以峰面積為縱坐標，濃度(μg/mL)為橫坐標，進行線性回歸分析，得野黃芩苷線性回歸方程：A=1137838.405×C-19848.177(R=0.9995，n=5)。結果表明：維生素D3在0.40～1.60 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.6 精密度考察

取維生素D3對照品貯存液1#，精密吸取500 μL，連續(xù)進樣6次，測定各自峰面積積分值，計算維生素D3峰面積的RSD為0.88%，充分說明本儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品溶液，在配置后于室溫放置0、2、4、6、8 h，分別精密進樣500 μL，最終維生素D3的峰面積積分值保持穩(wěn)定，RSD為1.00%，結果表明：供試品溶液中維生素D3在室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性實驗

取同一批次的碳酸鈣D3顆粒樣品，按照“2.2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液，分別精密進樣500 μL，記錄每份供試品溶液維生素D3成分的峰面積并進行含量計算。結果維生素D3的含量RSD值為0.50%，表明方法重復性良好。

2.9 回收率實驗

表1 回收率實驗結果

如表1所示，精密稱取維生素D3對照10.43 mg、12.54 mg、15.03 mg，加入0.02% 2,6-二叔丁基對甲酚的正己烷溶液10 mL，混勻，作為對照品貯存液，精密量取對照品貯存液1 mL 加0.02% 2,6-二叔丁基對甲酚的正己烷溶液50 mL，混勻，分別制得濃度為20.82 μg/mL、25.01 μg/mL、30.00 μg/mL的對照品貯存液。精密稱取陰性樣品10 g，分別加入不同濃度的對照品貯存液1 mL，按“2.2.2”項下方法制備相當于80%、100%、120%濃度的樣品溶液，每個濃度平行制備3份樣品，分別精密進樣500 μL，記錄每份供試品溶液維生素D3成分的峰面積并進行回收率計算，測得平均回收率為99.0%，RSD=1.50%。

2.10 樣品的含量測定

分別測得三批碳酸鈣D3顆粒樣品，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別精密進樣500 μL，記錄每份供試品溶液維生素D3成分的峰面積并進行含量計算。三批樣品結果分別為99.10%、102.31%、98.77%。

3 結 論

通過對維生素D3紫外波長掃描，結果維生素D3在265nm處有最大吸收，因而選擇265nm作為檢測波長。通過耐用性考察，分別對波長、柱溫、流速進行考察，最終得到最佳的色譜條件，確保制劑中維生素D3的色譜峰分離度、理論塔板數(shù)及保留時間均達到要求。通過進行方法學驗證中強制降解實驗得知。樣品中的維生素D3在加酸條件下有所降解，產(chǎn)生的降解物在已建立的色譜條件下均未見明顯的色譜峰，不干擾樣品中的維生素D3的測定。

本文建立了在碳酸鈣D3顆粒中維生素D3的含量測定方法，檢測方法操作簡單，對設備要求低，檢測結果的重現(xiàn)性良好，專屬性強，對含有維生素D3的制劑提供一種新的檢測方法。