胡乾坤，王倩倩，李強(qiáng)，黃晨璐，許偉，張毅，李新艷，陳良，黃玉仙

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心肝病科，上海 201508

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，嚴(yán)重影響人類健康。全球約有2.48億慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染相關(guān)疾病[1]，盡早規(guī)范抗病毒治療對于延緩疾病進(jìn)展、改善患者生命質(zhì)量至關(guān)重要。目前，聚乙二醇干擾素(peginterferon, Peg-IFN)是治療乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陽性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的一線藥物之一。雖然它能夠在有限的療程里提高HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率[2]，但仍有近2/3患者的治療結(jié)果不理想。研究表明基線高水平丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、低水平HBV DNA、HBV基因型[3]以及治療過程中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和HBV DNA的動態(tài)變化[4]等可作為Peg-IFN治療后是否發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測因子。然而，上述臨床參數(shù)多為病毒相關(guān)預(yù)測因子，有關(guān)宿主免疫功能的預(yù)測因子較少涉及。

microRNAs(miRNAs, miR)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)的非編碼小RNA[5]。HBV感染會改變宿主miRNAs譜，進(jìn)而影響病毒-宿主相互作用。其中，miR-155表達(dá)上調(diào)與CHB患者外周血免疫細(xì)胞活化密切相關(guān)[6, 7]，它能通過靶向細(xì)胞因子信號抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)促進(jìn)JAK/STAT信號通路活化從而增強(qiáng)固有免疫的抗HBV效應(yīng)[8]，而且外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中基線miR-155表達(dá)水平能預(yù)測抗病毒治療應(yīng)答[6]。循環(huán)中的miRNAs能夠以游離、核酸-蛋白復(fù)合物或包裹在外泌體的膜性囊泡等多種形式存在。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，外泌體源性miRNAs在診斷和預(yù)測疾病預(yù)后方面的價值逐漸得到顯現(xiàn)[9,10]。循環(huán)中的miR-155-5p能否作為預(yù)測Peg-IFN治療HBeAg陽性CHB療效的指標(biāo)尚不明確。為此，本研究回顧性分析了88例初次接受Peg-IFN治療的HBeAg陽性CHB患者的臨床資料，分別檢測基線血清和血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平，探討循環(huán)中的miR-155-5p及其他指標(biāo)對于Peg-IFN療效的預(yù)測效能，期望為臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

納入2016年6月至2019年6月在本中心肝病科初次接受Peg-IFN治療且完成48周療程的HBeAg陽性CHB患者88例。所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[11]的診斷標(biāo)準(zhǔn)及Peg-IFN抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①HBeAg和抗-HBe同時陽性；②入選前曾接受過抗病毒治療；③合并其他病毒感染，如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus, HDV)和戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)等；④服用免疫抑制劑(包括糖皮質(zhì)激素類藥物)或免疫功能缺陷；⑤基線血清不足或不可獲得；⑥未完成48周Peg-IFN治療。同時，選取24例健康受試者作為對照。本研究通過了本中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組患者和健康受試者均簽署了知情同意書，研究程序符合1975年《赫爾辛基宣言》。

1.2 治療方案和判斷標(biāo)準(zhǔn)

Peg-IFNα-2a (派羅欣?，180 μg/0.5 mL，上海羅氏制藥有限公司) 180 μg皮下注射，每周1次，連續(xù)治療48周。根據(jù)患者是否發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換分為治療應(yīng)答組和治療無應(yīng)答組。

1.3 基線血清miRNA、血清外泌體總RNA提取及miR-155-5p表達(dá)水平檢測

使用miRcute Serum/Plasma miRNA Isolation Kit(Cat No./ID：DP503, 北京天根生化科技有限公司)提取血清總miRNA。使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit (Cat No./ID:77044, 德國Qiagen公司)提取血清外泌體[12]，經(jīng)透射電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡法鑒定[13]后用QIAzol裂解外泌體并提取總RNA。使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit (Cat No./ID: C10712-1，廣州銳博生物科技有限公司)通過加polyA尾反轉(zhuǎn)錄法分別獲取總cDNA，再通過miR-155-5p特異的正向引物序列 (5′-AAGCGACCTTAATGCTAATCGTGAT-3′)和通用反向引物序列(5′-CAGTGCAGGGTCCG-AGGT-3′)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(poly merase chain reaction, PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min預(yù)變性后，95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s，重復(fù)40個循環(huán)。PCR儀器為StepOne PlusTM實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。每個樣本均重復(fù)測定3次。以Cel-miR-39為標(biāo)準(zhǔn)化外參，使用2-ΔΔCT方法[14]計算miR-155-5p的相對表達(dá)水平。

1.4 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測

血常規(guī)檢測采用全自動血細(xì)胞分析儀BC-3000 Plus(深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司)。肝功能檢測采用全自動生化分析儀7600 Series(日本日立公司)。HBV免疫標(biāo)志物采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ARCHITECTi 2000SR及配套專用試劑(美國雅培公司)。HBV DNA檢測采用HBV核酸定量檢測試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)，使用ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，最低檢測下限為 100 IU/mL。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 入組患者基線特征

入組患者基線資料見表1。88例CHB患者中，男性57例，女性31例，Peg-IFN治療48周發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換20例(22.73%)。以健康受試者為對照， CHB患者基線血清miR-155-5p(圖1A，P=0.046)和血清外泌體miR-155-5p(圖1B，P=0.011)均有不同程度升高。根據(jù)Peg-IFN治療結(jié)局將CHB患者分為治療應(yīng)答組與無應(yīng)答組，兩組間的年齡、性別、白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、總膽紅素、白蛋白、球蛋白、HBV基因型、HBsAg定量(表1)和血清miR-155-5p表達(dá)水平(圖1A)無統(tǒng)計學(xué)差異(P值均>0.05)。治療應(yīng)答組與治療無應(yīng)答組相比，前者基線ALT(P=0.027)和血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平 (圖1B，P<0.001) 明顯更高， 而基線HBeAg(P=0.011)和HBV DNA定量(P=0.007)明顯更低。

2.2 基線指標(biāo)與Peg-IFN療效的關(guān)系

采用單因素logistic回歸分析年齡、性別、ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBV DNA、血清miR-155-5p及血清外泌體miR-155-5p與Peg-IFN療效的相關(guān)性，篩查有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)測因子，然后共同納入多因素logistic回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基線血清外泌體miR-155-5p(OR=2.193，95%CI1.315～3.655，P=0.003)和HBV DNA(OR=0.398，95%CI0.163～0.976，P=0.036)是Peg-IFN治療48周后發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的獨(dú)立預(yù)測因子(表2)。

表1 入組患者基線特征 (n=88)

表2 Logistic回歸分析與干擾素治療應(yīng)答的相關(guān)指標(biāo)

A: Comparison of baseline serum miR-155-5p expression levels between healthy controls and total CHB patients, treatment non-response and response group. B: Comparison of baseline serum exosomal miR-155-5p expression levels between healthy controls and total CHB patients, treatment non-response and response group. Healthy controls were normalized to 1. HC, healthy controls; CHB, chronic hepatitis B; Non-R, non-response; R, response.

2.3 基線血清外泌體miR-155-5p和HBV DNA對Peg-IFN療效的預(yù)測效能

采用ROC曲線下面積評估基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平和HBV DNA定量水平對HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測效能，并根據(jù)約登指數(shù)選擇最佳截斷值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平在2.3時，ROC曲線下面積為0.788(95%CI0.682～0.893)，相應(yīng)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為65.0%、82.4%、52.0%和88.9%(表3)。當(dāng)基線HBV DNA定量水平在7.2 log10IU/mL時，ROC曲線下面積為0.704(95%CI0.577～0.824)，相應(yīng)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為80.0%、57.4%、35.6%和90.7%(表3)。兩者聯(lián)合后的ROC曲線下面積將增加到0.823(95%CI0.721～0.924)(圖2)。

2.4 不同基線特征CHB患者的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率比較

根據(jù)基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平(截斷值2.3)和HBV DNA定量水平(截斷值 7.2 log10IU/mL)的不同，將入組CHB患者分為不同亞組，比較各亞組經(jīng)Peg-IFN治療48周后的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平≥2.3且HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的15例患者中，有10例發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(66.67%)；基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平≥2.3但HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的10例患者中，有3例發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(30.00%)；基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平<2.3但HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的30例患者中，有6例發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(20.00%)；而基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平<2.3且HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的33例患者中，僅1例發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(3.03%)(圖3)。

表3 基線血清外泌體miR-155-5p和HBV DNA對治療應(yīng)答的預(yù)測效能

圖2 基線血清外泌體miR-155-5p、HBV DNA以及聯(lián)合應(yīng)用對Peg-IFN療效的預(yù)測效能

“Y” denotes yes, and “N” denotes no.

3 討論

對于HBeAg陽性CHB患者而言，經(jīng)Peg-IFN治療后實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換標(biāo)志著部分免疫控制和長期病毒學(xué)抑制，是抗病毒治療應(yīng)答的關(guān)鍵指標(biāo)。在臨床實(shí)踐中，根據(jù)早期參數(shù)預(yù)測Peg-IFN的療效，有助于對CHB患者的抗病毒方案進(jìn)行優(yōu)化。本研究發(fā)現(xiàn)，基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平和HBV DNA定量水平均可作為Peg-IFN治療48周發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的獨(dú)立預(yù)測因子?；€血清外泌體miR-155-5p預(yù)測Peg-IFN療效的最佳截斷值是2.3，相應(yīng)的 ROC曲線下面積為0.788，靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為65.0%、82.4%、52.0%和88.9%?；€HBV DNA預(yù)測Peg-IFN療效的最佳截斷值是 7.2 log10IU/mL，相應(yīng)的ROC曲線下面積為0.704，靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為80.0%、57.4%、35.6%和90.7%。

miR-155位于人類21號染色體B細(xì)胞整合簇(B-cell Integration Cluster，BIC)基因的第3個外顯子內(nèi)，它在血細(xì)胞發(fā)育、腫瘤生成、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮調(diào)控作用[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)口腔皰疹病毒感染能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生miR-155，并能直接靶向SOCS1激活I(lǐng)FN信號通路來增強(qiáng)固有免疫系統(tǒng)抗病毒能力。此外，對于免疫耐受或免疫缺陷患者來說，因免疫細(xì)胞功能障礙造成的SOCS1表達(dá)增加和miR-155表達(dá)下調(diào)，可能是他們對IFN抗病毒或抗腫瘤治療反應(yīng)不佳的原因。Sarkar等[17]發(fā)現(xiàn)HBV感染者miR-155表達(dá)和Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)表達(dá)呈正相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明miR-155通過靶向CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBP-β)抑制HBV復(fù)制。Ge等[6]發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)下調(diào)與CHB患者外周血自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的功能障礙密切相關(guān)，在活化的NK細(xì)胞中過表達(dá)miR-155能明顯促進(jìn)IFN-γ和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的生成。Fang等[7]則發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)水平與CHB患者CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化呈正相關(guān)，提示前者可能是慢性HBV感染者免疫激活的潛在標(biāo)志物。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，免疫活動期的CHB患者機(jī)體免疫耐受被打破，肝臟炎癥反應(yīng)明顯，血清miR-155-5p和血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平均有不同程度升高。因此，miR-155-5p在病毒與宿主相互作用，尤其是在慢性HBV感染與機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

既往研究表明CHB患者PBMCs、循環(huán)以及肝組織中存在特異變化的miRNAs，并且基線PBMCs和循環(huán)中差異表達(dá)的miRNAs可以作為Peg-IFN療效的預(yù)測因子[18,19]。然而，基線循環(huán)中的miR-155-5p是否存在差異表達(dá)以及能否作為Peg-IFN 治療HBeAg陽性CHB患者的療效預(yù)測因子尚不明確。為此，本研究以健康受試者為對照，檢測了治療應(yīng)答和無應(yīng)答組基線血清miR-155-5p表達(dá)水平，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)兩組間的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.084)。進(jìn)一步檢測基線血清外泌體miR-155-5p的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間表達(dá)存在顯著差異(P<0.001)，并且能夠用于預(yù)測Peg-IFN的療效。雖然HBeAg陽性CHB患者的血清和血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平均有不同程度升高，但基線血清外泌體miR-155-5p對于預(yù)測Peg-IFN的療效更具優(yōu)勢。分析原因如下：①外泌體的囊泡結(jié)構(gòu)能保護(hù)miRNA分子免受循環(huán)中RNA酶的降解[20]，從而增強(qiáng)了其作為標(biāo)志物的穩(wěn)定性和診斷潛能。②外泌體的內(nèi)容物與血清或血漿樣本并不完全一致，有些差異表達(dá)miRNAs可能在外泌體中富集[21]。在CpG聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷模型中，血漿外泌體源性miR-155表達(dá)明顯增加，而血漿蛋白結(jié)合的miR-155表達(dá)明顯減少[22]。Matsuura等[23]也發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者的肝組織、血漿和血漿外泌體中的let-7s表達(dá)水平無相關(guān)性。③基于外泌體的生物標(biāo)志物分析與血清或血漿樣本相比，前者樣本內(nèi)容物的復(fù)雜性明顯降低，一定程度上減少了血清或血漿復(fù)雜背景所造成的干擾[24]。④miRNAs并非隨機(jī)包裹進(jìn)入外泌體，機(jī)體在不同病理生理狀態(tài)下具有引導(dǎo)特異miRNAs進(jìn)入外泌體的分選機(jī)制[25]。因此，我們推測HBeAg陽性CHB患者血清外泌體miR-155-5p的高表達(dá)，一定程度上反映了宿主免疫耐受的打破和免疫功能的重建，活化的免疫細(xì)胞合成的miR-155-5p會優(yōu)先分選進(jìn)入外泌體，而治療應(yīng)答組CHB患者處于相對較高的免疫激活狀態(tài)，體內(nèi)免疫細(xì)胞合成并釋放外泌體miR-155-5p的能力更強(qiáng)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用IFN治療相對容易實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。

基線HBV DNA定量在預(yù)測Peg-IFN療效中的價值已得到多個研究證實(shí)。對于HBV 基因型B型或C型的CHB患者來說，基線低水平HBV DNA(<2×108IU/mL)和基線高水平ALT(≥2ULN)的患者更可能對Peg-IFN治療產(chǎn)生應(yīng)答[3]。Fan等[26]研究表明基線低水平HBV DNA(<9 log10copies/mL)和基線高水平乙型肝炎核心抗體(hepatitis B core antibody, HBcAb)(≥ 4.4log10IU/mL)的CHB患者，經(jīng)Peg-IFN治療后有65.8%(50/76)發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，將基線血清外泌體miR-155-5p和HBV DNA聯(lián)合分析，能進(jìn)一步提高對Peg-IFN療效的預(yù)測效能。基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平≥2.3且HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的患者，Peg-IFN治療48周后的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率最高，達(dá)到66.67%(10/15)，而基線血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平<2.3且HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的患者，Peg-IFN治療48周后的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率最低，僅為3.03%(1/33)。

本研究也存在一定局限性。首先，本研究屬于單中心的回顧性隊列研究，納入的患者數(shù)量有限，部分患者因信息缺失或治療中斷而排除，這可能會對研究結(jié)果造成偏倚，因此需要大樣本的前瞻性隊列研究來驗(yàn)證現(xiàn)有結(jié)論的真實(shí)性和可靠性。其次，基線血清外泌體miR-155-5p預(yù)測Peg-IFN療效的具體作用機(jī)制以及Peg-IFN治療過程中血清外泌體miR-155-5p的動態(tài)變化情況有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，基線血清外泌體miR-155-5p聯(lián)合HBV DNA定量可以預(yù)測Peg-IFN 治療HBeAg陽性CHB 患者48周發(fā)生的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。研究對于優(yōu)化HBeAg陽性CHB患者的抗病毒治療方案及提高Peg-IFN抗病毒治療效果可能有積極作用。