荊沙，馬澤林，趙超,2

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院)，上海 200040

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的持續(xù)性感染可造成慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，后期發(fā)展為致命性肝病。全球約有2.6億慢性HBV感染者，其中約88.7萬人死于HBV相關(guān)的肝硬化、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)等終末期肝臟疾病[1]。肝臟是脂質(zhì)代謝的必要器官，而肝臟脂質(zhì)代謝失衡會(huì)導(dǎo)致異常的脂質(zhì)積累，引起肝細(xì)胞脂肪變性，進(jìn)而發(fā)展為嚴(yán)重肝臟疾病[2]。

HBV屬于正嗜肝DNA病毒屬，其基因組約有 3 200 個(gè)堿基對(duì)。HBV基因組含有4個(gè)開放閱讀框，可合成9種病毒蛋白。HBV的包膜蛋白，包括大蛋白、中蛋白、小蛋白，統(tǒng)稱為乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)。當(dāng)HBV DNA整合到宿主細(xì)胞基因組中后，即使HBV復(fù)制水平很低， HBsAg也仍可持續(xù)表達(dá)[3]。HBsAg的持續(xù)存在不僅是乙型肝炎慢性化的標(biāo)志，也是重要的致病因素。肝內(nèi)HBsAg的大量表達(dá)與嚴(yán)重肝臟疾病進(jìn)展相關(guān)[4-6]。此外，有研究表明，血清HBsAg水平和持續(xù)時(shí)間與宿主免疫耐受狀態(tài)呈正相關(guān)性，高水平的HBsAg使機(jī)體無法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[7]。HBsAg能與宿主來源的脂質(zhì)裝配組成亞病毒顆粒。在HBV持續(xù)性感染中，亞病毒顆粒數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過完整的病毒顆粒，可達(dá)后者 1 000 倍以上。亞病毒顆粒本質(zhì)上是一種脂蛋白，其脂質(zhì)與蛋白質(zhì)之比約為0.35，這些顆粒的形成需要大量宿主來源的脂質(zhì)[8]。因此，CHB患者體內(nèi)持續(xù)性產(chǎn)生的大量亞病毒顆粒需要不斷消耗肝細(xì)胞脂質(zhì)，可引起肝臟脂質(zhì)代謝異常。

近年來，HBV X蛋白(HBV X protein，HBx)、核心蛋白調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的多種機(jī)制時(shí)有報(bào)道[9-12]，但關(guān)于HBsAg與宿主脂質(zhì)代謝調(diào)控的研究較少。此外，關(guān)于HBV持續(xù)性感染與肝臟脂質(zhì)代謝之間關(guān)系的臨床數(shù)據(jù)與體外研究、動(dòng)物模型結(jié)果均存在矛盾。一項(xiàng)隊(duì)列研究表明，與HBsAg陰性者相比，HBsAg陽性者發(fā)生非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的風(fēng)險(xiǎn)更低[13,14]，而涉及的機(jī)制尚不明確。本研究對(duì)穩(wěn)定表達(dá)HBsAg的HepG2-S-G2細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系HepG2-neo-F4進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，探討HBsAg對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制，期望對(duì)HBV持續(xù)性感染與肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)系研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

HepG2.2.15細(xì)胞系：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含4個(gè)5′-3′串聯(lián)的HBV基因組的質(zhì)粒pDolTHBV-1入HepG2細(xì)胞系[15]，購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心。

HepG2-neo-F4細(xì)胞系：將空載質(zhì)粒pCMV-script轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，構(gòu)建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，本課題組構(gòu)建[16]。

HepG2-S-G2細(xì)胞系：將C型HBV分離株 C8[17]中的SHBs基因克隆片段插入pCMV-script質(zhì)粒，構(gòu)建成pCMV-S質(zhì)粒。將pCMV-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，構(gòu)建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，本課題組構(gòu)建[16]。

3種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系均在遺傳霉素(geneticin，G418)篩選下傳代培養(yǎng)，并置于液氮保存。

1.1.2 培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CORNING公司，G418購(gòu)自加拿大WISENT公司。

1.1.3 試劑辛伐他汀、洛伐他汀及油紅O染色液(培養(yǎng)細(xì)胞專用)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。TRIZOL購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Eastep?RT Master Mix Kit 購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，GoTaq?qPCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Promega公司。游離脂肪酸(non-esterified fatty acids，NEFA)檢測(cè)試劑盒和總膽固醇(total cholesterol，TCHO)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物有限公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(99.7%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本東仁化學(xué)公司，3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶1(3-oxoacid CoA-transferase 1，OXCT1)抗體和細(xì)胞色素氧化酶P450家族4亞家族F成員3(cytochrome P450 family 4 subfamily F member 3，CYP4F3)抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，β-actin 抗體購(gòu)自上海Abmart公司，山羊抗兔抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.4 引物OXCT1[18]和CYP4F3[19]熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物由華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.1.5 儀器PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，WB電泳槽和凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)所用細(xì)胞均在含有10%胎牛血清、200 μg/mL G418培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析將培養(yǎng)HepG2-S-G2細(xì)胞和HepG2-neo-F4細(xì)胞的12孔板中的培養(yǎng)基吸棄后，加入適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗2遍。加入TRIZOL，用移液器反復(fù)吹打孔內(nèi)細(xì)胞20～30次(冰上操作)，同組的3孔細(xì)胞均轉(zhuǎn)移入同一預(yù)冷1.5 mL離心管，混合均勻，迅速轉(zhuǎn)移入 -80 ℃冰箱保存或直接抽提細(xì)胞RNA。

采用Agilent Bioanalyzer 2100進(jìn)行質(zhì)檢，Qubit?3.0 Fluorometer和NanoDrop One定量總RNA。RNA樣本量、純度、完整性均合格，方可進(jìn)行后續(xù)操作。構(gòu)建paired-end文庫(kù)，即用poly-T寡聚磁珠純化含有poly-A的mRNA。純化后的mRNA在94 ℃下8 min解離成小片段，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。利用DNA聚合酶和RNA酶H合成第2鏈cDNA。cDNA經(jīng)過末端修復(fù)后，3′末端添加單個(gè)堿基A和連接接頭。然后通過PCR對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和富集，創(chuàng)建最終的測(cè)序樣本cDNA文庫(kù)，并對(duì)純化后的文庫(kù)進(jìn)行定量。使用Agilent Bioanalyzer 2100進(jìn)行驗(yàn)證，以確定插入物的大小并計(jì)算摩爾濃度。依照cBot User Guide的標(biāo)準(zhǔn)流程，利用稀釋至10 pmol/L的文庫(kù)完成簇生成。在Illumina NovaSeq6000(Illumina，USA)上測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì)。計(jì)算出表征基因表達(dá)定量的FPKM(fragments perkilobase million)值，以用于不同樣本間的橫向比較。對(duì)樣本組間基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，計(jì)算得到P值后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，校正后的P值被稱為q值。同時(shí)，根據(jù)FPKM值計(jì)算差異表達(dá)倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)，常用log2(FC)來表示。本次差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：q值<0.05且 FC>2，篩選差異基因并繪制差異基因分布圖。基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://deweylab.github.io/RSEM/, https://github.com/TransDecoder)，對(duì)上述篩選到的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，找到顯著富集的相關(guān)通路。q值<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)差異基因OXCT1和CYP4F3的mRNA表達(dá)TRIZOL法抽提HepG2-S-G2細(xì)胞和HepG2-neo-F4細(xì)胞的總RNA，用Eastep?RT Master Mix Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第1鏈cDNA，用GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒(實(shí)時(shí)熒光定量PCR法)對(duì)OXCT1和CYP4F3基因的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。OXCT1和CYP4F3的實(shí)時(shí)PCR引物見表1。實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)條件為95 ℃ GoTaq?Hot Start聚合酶激活2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。管家基因β-actin作為內(nèi)參，actin的引物見表1。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)差異基因OXCT1和CYP4F3的蛋白表達(dá)裂解細(xì)胞蛋白并用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法檢測(cè)蛋白濃度后，加入5×loading buffer， 100 ℃恒溫煮沸蛋白約 10 min， 微離心后使用WB檢測(cè)蛋白表達(dá)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

上樣后，樣品在SDS-PAGE濃縮膠中以80 V恒壓電泳30 min，待蛋白遷移至10% SDS-PAGE分離膠時(shí)，調(diào)高電壓至110 V恒壓，繼續(xù)電泳約1.5 h。用聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，280 mA恒流1.5 h。將有蛋白印跡的PVDF膜浸入5%(w/v)脫脂奶粉封閉2 h。將膜放入孵育液，一抗孵育4 ℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffer saline with tween，PBST)或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽吐溫緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗膜。適當(dāng)稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，置室溫避光孵育1 h。再次洗膜后，將膜正面朝上，置于凝膠成像系統(tǒng)Image Lab 3.0軟件進(jìn)行曝光顯色。

1.2.5 油紅O染色觀察HepG2-S-G2細(xì)胞的脂質(zhì)水平37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)HepG2-S-G2和HepG2-neo-F4細(xì)胞48～72 h。PBS清洗后取固定液Cell ORO Fixative固定細(xì)胞15～25 min，稍沖洗，晾干后滴加油紅O染色液(ORO Stain A: ORO Stain B以3∶2比例混合，靜置約10 min，現(xiàn)用現(xiàn)配)，染色10～15 min。稍沖洗后加入Mayer蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核1～2 min，顯微鏡下觀察。

1.2.6 細(xì)胞游離脂肪酸與總膽固醇檢測(cè)裂解細(xì)胞蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，每個(gè)蛋白樣品設(shè)置5～7個(gè)重復(fù)孔，分別按照NEFA和TCHO試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。在96孔板的空白孔、校準(zhǔn)孔、樣本孔中分別加入雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本后，再加入工作液，混勻后，置37 ℃恒溫孵育5 min/10 min，酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞降脂處理后檢測(cè)HBsAg將HepG2.2.15細(xì)胞傳代并均勻接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)液更換成無血清DMEM，饑餓處理12～18 h。將辛伐他汀、洛伐他汀分別溶于DMSO，各自配制成1 μmol/L和 5 μmol/L 兩種濃度的溶液；對(duì)照組為等量DMSO處理，并在24 h撤去舊培養(yǎng)基，換成對(duì)應(yīng)藥物濃度的新培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的HBsAg及CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖。 樣品適當(dāng)稀釋后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HBsAg含量(半定量)。利用CCK8的檢測(cè)結(jié)果對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行均一化處理后，計(jì)算各組細(xì)胞HBsAg分泌量與對(duì)照組細(xì)胞的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Graphpad Prism 6.02軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本差異顯著性的t檢驗(yàn)(除轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析外)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05時(shí)認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組篩選到脂質(zhì)代謝差異基因與富集通路

為排除機(jī)體多種復(fù)雜因素的影響，針對(duì)性研究HBsAg與宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系，選用穩(wěn)定持續(xù)性表達(dá)HBsAg的細(xì)胞系HepG2-S-G2及其對(duì)照細(xì)胞系HepG2-neo-F4，通過對(duì)兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的對(duì)比分析，篩選出515個(gè)差異基因，結(jié)果如圖1。

經(jīng)KEGG分析發(fā)現(xiàn)，在“代謝”這一功能分類中，除全局和概覽通路(global and overview maps)外，差異基因數(shù)目最多的是脂質(zhì)代謝通路，如圖2A。KEGG富集到243條通路，通過進(jìn)一步分析脂質(zhì)代謝中的次級(jí)通路富集發(fā)現(xiàn)，脂肪酸合成通路的富集程度最高，即富集因子最高；其次為初級(jí)膽汁酸合成通路、亞油酸代謝途徑，如圖2B。

A: X-axis represents the gene expression abundances of HepG2-neo-F4 and Y-axis represents the gene expression abundances of HepG2-S-G2 cells. B: Log2 (Fold-change) represents the fold change of differential genes expression. -Lg10 (q-value) indicates the degree of the difference. q-value< 0.05 and | log2 (fold change) | >1 were all differential genes. Red indicates the up-regulated differential genes of cells, and blue indicates the down regulated differential genes of cells in A and B.

A: X-axis represents the number of differential genes, and Y-axis represents the function annotation of class 2 under the six classifications of KEGG database. The red box is the focus of this study. B: The enrichment pathway in lipid metabolism. Combined with X-axis, the secondary lipid metabolism pathway with different enrichment degree can be found in Y-axis.

2.2 HBsAg上調(diào)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成網(wǎng)絡(luò)

為明確脂質(zhì)代謝通路中差異基因的作用，分析脂質(zhì)代謝通路中篩選發(fā)現(xiàn)的13個(gè)差異基因，其中8個(gè)表達(dá)基因上調(diào)、5個(gè)表達(dá)基因下調(diào)，均為顯著差異表達(dá)，變化范圍在2～10倍，如圖3。

結(jié)合脂質(zhì)代謝通路差異基因的分析發(fā)現(xiàn)，參與脂肪酸合成通路的2個(gè)差異基因轉(zhuǎn)錄水平均被上調(diào)，即長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶1(acyl-CoA synthetase long chain family member，ACSL1)基因和線粒體3-酮脂酰-?；d體蛋白合成酶(3-oxoacyl-acyl carrier protein synthase, mitochondrial，OXSM)基因。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中這些基因表達(dá)蛋白通路中作用來看，作為脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，ACSL1和OXSM的顯著上調(diào)可促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的從頭合成。膽汁酸輔酶A：氨基酸N-?；D(zhuǎn)移酶(bile acid-CoA: amino acid N-acyltransferase，BAAT)、人分泌磷脂酶A2-IIA(phospholipase A2 group ⅡA，PLA2G2A)和脂肪特異性磷脂酶A2第16型(phospholipase A2 type 16，PLA2G16)基因表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)不飽和脂肪酸生成；而細(xì)胞色素氧化酶P450家族4亞家族F成員3(cytochrome P450 family 4 subfamily F member 3，CYP4F3)基因表達(dá)下調(diào)可減少花生四烯酸等不飽和脂肪酸進(jìn)一步代謝。肝型脂肪酶C(lipase C，LIPC)基因表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)脂肪酸和膽固醇合成，二磷酸尿苷葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族2成員A3(uridine diphosphate glucuronosyltransferase family 2 member A3，UGT2A3)下調(diào)可以減少膽固醇向類固醇激素的轉(zhuǎn)化。根據(jù)以上脂質(zhì)代謝差異基因表達(dá)的關(guān)鍵酶主要參與脂肪酸和膽固醇代謝過程的提示，推測(cè)了HBsAg引起細(xì)胞脂肪酸和膽固醇等脂質(zhì)合成增強(qiáng)、消耗分解減少等代謝變化的潛在機(jī)制，如圖4。

2.3 HBsAg影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因OXCT1和CYP4F3的轉(zhuǎn)錄

脂質(zhì)代謝通路差異基因分析提示，與對(duì)照細(xì)胞相比，HepG2-S-G2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中OXCT1基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)約10倍，CYP4F3基因下調(diào)為對(duì)照細(xì)胞的1/4左右。為檢測(cè)HepG2-S-G2、HepG2-neo-F4細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中篩選分析出的脂質(zhì)代謝差異基因的可信度，使用實(shí)時(shí)PCR對(duì)上述兩個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，與HepG2-neo-F4細(xì)胞相比，HepG2-S-G2細(xì)胞的OXCT1 mRNA水平升高約9倍(圖5A)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致；HepG2-S-G2細(xì)胞的CYP4F3轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)下調(diào)，與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相符(圖5B)。

2.4 HBsAg影響脂質(zhì)通路OXCT1和CYP4F3蛋白表達(dá)

為明確轉(zhuǎn)錄水平的差異基因是否在蛋白水平發(fā)生相應(yīng)變化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)后續(xù)脂質(zhì)代謝的調(diào)控，利用WB檢測(cè)OXCT1和CYP4F3的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖6所示，OXCT1和CYP4F3蛋白均出現(xiàn)相應(yīng)的顯著上調(diào)、下調(diào)表達(dá)，并且趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析一致。

The differential genes involved in lipid metabolism in the histogram. Y-axis represents the fold change of differences, and X-axis represents the names of the differential genes. Orange bars represent up-regulated genes, while green bars represent down regulated genes. #0.01

Long bars represent related products in lipid metabolism. Elliptical frames represent some differential key enzymes, among which blue represents up-regulated gene and light color represents down regulated gene. The solid arrow represents direct action, and the dotted arrow represents indirect action.

A: The OXCT1 mRNA expression of HepG2-S-G2 is significantly higher than that of HepG2-neo-F4. B: The CYP4F3 mRNA expression of HepG2-S-G2 is significantly lower than that of HepG2-neo-F4. * * * *: P<0.000 1.

A: The OXCT1 protein of HepG2-S-G2 is distinctly higher than that of HepG2-neo-F4. B: The CYP4F3 protein expression of HepG2-S-G2 is distinctly lower than that of HepG2-neo-F4. β-actin: internal reference protein. The neo-F4 and S-G2 marked on the top of figure A and B respectively represent HepG2-neo-F4 and HepG2-S-G2 cells. The expression of OXCT1 and CYP4F3 in two cells were detected by western blot.

2.5 HBsAg產(chǎn)生促細(xì)胞脂質(zhì)合成的表型

為了驗(yàn)證HBsAg對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)合成、積累的表型具有促進(jìn)作用，通過油紅O染色和檢測(cè)細(xì)胞NEFA、TCHO水平來評(píng)估HepG2-S-G2細(xì)胞、HepG2-neo-F4細(xì)胞的脂質(zhì)水平。結(jié)果顯示，與HepG2-neo-F4細(xì)胞相比，HepG2-S-G2細(xì)胞中出現(xiàn)更加明顯的脂質(zhì)堆積，形成更明顯脂滴，如圖7。另外，HepG2-S-G2細(xì)胞中NEFA的相對(duì)增長(zhǎng)倍數(shù)、TCHO的濃度水平均顯著高于對(duì)照細(xì)胞，結(jié)果如圖8所示。

2.6 降脂處理對(duì)HBsAg調(diào)控的影響

上述結(jié)果表明，HBsAg上調(diào)細(xì)胞脂質(zhì)代謝，促進(jìn)脂質(zhì)合成和積累。為研究下調(diào)脂質(zhì)合成是否能有效降低HBsAg水平，即兩者之間是否存在相互調(diào)控機(jī)制，選用辛伐他汀和洛伐他汀對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制子的HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行降脂處理。結(jié)果表明，降脂處理在該細(xì)胞系中表現(xiàn)出顯著減少HBsAg分泌的作用，與對(duì)照組相比，1 μmol/L、5 μmol/L 的辛伐他汀和洛伐他汀處理組的細(xì)胞外HBsAg水平分別呈劑量依賴性降低(圖9)。

The lipid droplets were stained with the cell oil red O staining kit and observed in the bright field of the ordinary inverted microscope. The red signal shows the lipid accumulation, and the scale is 10 μm.

A: Taking HepG2-neo-F4 as the control, Y-axis shows the intracellular NEFA fold change. B: Y-axis shows the intracellular TCHO concentration. * 0.01

In order to eliminate the influence of cell proliferation, the average HBsAg secretion level of each cell was calculated by the ratio of HBsAg compared with that of DMSO group after normalized by CCK8 in Y-axis. The percentage of HBsAg level in each group was shown, and the inhibition rate of HBsAg in each group was obtained by subtracting this percentage from 100%.

Fig.9 The inhibitory effect of statins on HBsAg secretion by the HepG2.2.15 cells

3 討論

HBV是包膜病毒，大量HBsAg的合成與分泌可干擾宿主細(xì)胞正常生理活動(dòng)，尤其是脂質(zhì)代謝等途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg通過調(diào)控關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞脂質(zhì)代謝途徑，同時(shí)HBsAg上調(diào)多種脂肪酸合成通路、抑制膽固醇消耗途徑。其中HBsAg促進(jìn)檸檬酸循環(huán)的結(jié)果與已報(bào)道的HBV pre-S2通過激活三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)檸檬酸鹽裂解酶促進(jìn)糖酵解和脂質(zhì)生物合成機(jī)制[20]存在相似之處。這些結(jié)果提示HBsAg可通過不同通路引起脂質(zhì)代謝上調(diào)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

脂滴是細(xì)胞的一種動(dòng)態(tài)的能量?jī)?chǔ)存結(jié)構(gòu)，主要包含中性脂質(zhì)。當(dāng)發(fā)生代謝紊亂或能量過剩時(shí)，往往導(dǎo)致肝臟脂滴中異常的脂質(zhì)堆積。本研究通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中形成大而明顯脂滴，提示持續(xù)表達(dá)HBsAg的肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂。目前，通常認(rèn)為脂滴形成于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂滴積累[21]。因此，提示HBsAg引起的脂滴中脂質(zhì)堆積可能存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)機(jī)制。另外，在脂質(zhì)代謝失衡引發(fā)的肝纖維化、HCC等多種肝臟疾病中，也都伴隨著血清脂質(zhì)水平的顯著變化。研究表明，與CHB患者相比，HBV相關(guān)的肝硬化、HCC患者血清TCHO和甘油三酯水平均顯著降低。而與HBV相關(guān)肝硬化患者相比，HBV相關(guān)HCC患者血清中TCHO水平顯著升高[22]。本研究利用酶法檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)水平的結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，HepG2-S-G2細(xì)胞內(nèi)TCHO、NEFA水平均顯著升高，表明HBsAg引起的基因轉(zhuǎn)錄水平差異，進(jìn)一步造成相應(yīng)蛋白水平變化并引發(fā)細(xì)胞調(diào)控導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性的脂質(zhì)合成上調(diào)。同時(shí)該表型也與分析總結(jié)的HBsAg引起關(guān)鍵酶的差異表達(dá)來調(diào)控脂質(zhì)代謝結(jié)果一致?？偟膩砜矗x差異基因編碼的關(guān)鍵酶主要參與脂肪酸和膽固醇的代謝過程，起到增加合成、減少消耗的作用，推測(cè)細(xì)胞通過以上相關(guān)代謝的變化來維持HBsAg持續(xù)性表達(dá)與分泌的物質(zhì)、能量需要。

脂質(zhì)代謝的上調(diào)可以促進(jìn)HBx表達(dá)，兩者存在相互調(diào)控機(jī)制。研究表明， HBx可增強(qiáng)甾醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ的轉(zhuǎn)錄活性及肝脂肪酸結(jié)合蛋白1的表達(dá)，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累[9,10]；而脂肪酸積累通過活性氧和Ca2+信號(hào)維持HBx穩(wěn)定并促進(jìn)肝臟炎癥基因表達(dá)[11]。為了探討脂質(zhì)代謝與HBsAg是否存在相互調(diào)控作用，本研究利用辛伐他汀和洛伐他汀對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制子的HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)降脂能夠顯著降低HBsAg水平，提示脂質(zhì)代謝可對(duì)HBsAg存在調(diào)控作用，降脂可能成為降低HBsAg的有效途徑。他汀類藥物通常被作為3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，靶向抑制肝細(xì)胞HMG-CoA轉(zhuǎn)化為膽固醇前體-甲羥戊酸，阻斷肝臟中膽固醇的產(chǎn)生。同時(shí)，他汀類藥物通過促進(jìn)SREBP移位至細(xì)胞核并增強(qiáng)低密度脂蛋白受體基因表達(dá)，使得肝臟釋放出更多受體來清除低密度脂蛋白膽固醇[23]。曾有報(bào)道稱，洛伐他汀并不抑制HBsAg的mRNA轉(zhuǎn)錄[24]。HBsAg本質(zhì)上是一種糖蛋白，可利用宿主脂質(zhì)自行組裝成大量22 nm的亞病毒顆粒并分泌到胞外[25]。作為寡糖載體，多萜醇磷酸鹽是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中糖蛋白N連接糖基化的必需輔助因子，而洛伐他汀可顯著減少多萜醇合成[26]，推測(cè)他汀類藥物可能干擾HBsAg的合成。另外，膽固醇及其衍生物是亞病毒顆粒的主要成分之一，他汀類藥物可能通過降低膽固醇含量對(duì)亞病毒顆粒的產(chǎn)生與分泌發(fā)揮重要作用[25]。總之，他汀類藥物抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本研究分析了穩(wěn)定表達(dá)HBsAg的細(xì)胞系HepG2-S-G2與對(duì)照細(xì)胞系HepG2-neo-F4的脂質(zhì)代謝通路中限速酶基因轉(zhuǎn)錄組水平差異，并初步探討了脂質(zhì)代謝與HBsAg的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步理解HBV與宿主脂質(zhì)代謝的相互調(diào)控機(jī)制提供了參考。