楊思宇，徐水寶，陳重，張文宏，金嘉琳，陳澍

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科, 上海 200040； 2. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系, 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室, 上海 200030

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)屬腸桿菌科克雷伯菌屬，是重要條件致病菌，可引起肺炎、血流感染、尿路感染和肝膿腫等疾病[1]。碳青霉烯類抗生素是目前療效最確切的耐藥革蘭陰性菌感染治療藥物，但碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumonia, CRKP)檢出率呈快速上升趨勢，且CRKP大多呈現(xiàn)出多重耐藥性，更易引起醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生，給臨床診療和感染控制帶來了極大的困難[2,3]。

本研究對上海市某三甲醫(yī)院就診患者血標(biāo)本分離的CRKP菌株進(jìn)行耐藥表型和分子流行病學(xué)分析，明確該地區(qū)的耐藥現(xiàn)狀與傳播規(guī)律，以期對CRKP的臨床合理用藥及精準(zhǔn)防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及鑒定

收集上海市某三甲醫(yī)院2015年4月至2018年3月期間確診血流感染的住院患者血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中分離的KP臨床株。若發(fā)生多次血流感染，僅納入第1次。菌株按常規(guī)方法接種、培養(yǎng)和純化，采用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定細(xì)菌種屬。CRKP定義為對亞胺培南或美羅培南其中一種藥物耐藥的KP。

1.2 病例資料

使用住院患者病史采集系統(tǒng)及聯(lián)眾病史系統(tǒng)，對入組患者臨床資料進(jìn)行收集分析，包括患者性別、年齡、所在科室、住院天數(shù)、轉(zhuǎn)科經(jīng)歷、手術(shù)及侵入性操作、診斷、住院期間用藥及預(yù)后等信息[4]。

1.3 藥敏試驗

按照2018年版美國臨床和實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的藥敏試驗要求[5]，使用紙片擴(kuò)散法或瓊脂稀釋法進(jìn)行15種抗菌藥物的敏感性試驗。大腸埃希菌ATCC25922和KP ATCC13883作為質(zhì)控菌。替加環(huán)素的藥敏結(jié)果按照美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀(https://www.fda.gov/drugs/development-resources/antibacterial-susceptibility-test-interpretive-criteria)，其他抗菌藥物的藥敏結(jié)果根據(jù)2018年版CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀[5]。

1.4 耐藥基因檢測

使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增檢測5種碳青霉烯酶基因:blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM，參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行引物設(shè)計并設(shè)置反應(yīng)條件[6]。 PCR陽性產(chǎn)物的測序序列上傳至https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行比對。

1.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

參照Diancourt 等的方法設(shè)計引物并設(shè)置反應(yīng)條件[7]，對KP基因組上的7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物的測序序列上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(www.pasteur.fr/mlst/Kpneumoniae.html)進(jìn)行比對分型，并確定序列型(ST)。

1.6 脈沖場凝膠電泳分析

按Tenover等人推薦的方法對CRKP臨床菌株進(jìn)行脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)[8]，制備好細(xì)菌包埋膠塊，經(jīng)裂解、清洗、XbaI酶切后，置于1% SeaKem Gold凝膠中電泳，電泳時間19 h。成像得到的圖片使用Bionumerics軟件處理，對電泳條帶進(jìn)行聚類分析，比較菌株間的親緣關(guān)系并繪制系統(tǒng)樹。采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair-group method with Arithmetic mean，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，以Dice系數(shù)分析比較菌株的同源性，PFGE帶型相似性>85%分類為同一簇，相似性100%時認(rèn)定為同一基因型別(PFGE types，PT)。

2 結(jié)果

2.1 CRKP的檢出及分布

從2015年4月至2018年3月血流感染患者血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中分離到非重復(fù)KP 115株。從中篩選到51株CRKP，檢出率44.3%。將CRKP菌株命名為K1-K51。

獲得的CRKP主要來自該院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU) 14株(27.5%)、感染病科13株(25.5%)、神經(jīng)外科11株(21.6%)和普外科8株(15.7%)，其余來自腎內(nèi)科2株，泌尿外科、抗生素科和綜合科各1株。51例CRKP血流感染患者中，院內(nèi)感染為39例(76.5%)，衛(wèi)生保健相關(guān)的7例(13.7%)，社區(qū)獲得的5例(9.8%)。

時間分布上，每個季度的檢出率在0.00～76.9%不等，詳見表1。2015年第3季度未檢出，2017年第2季度檢出例數(shù)最多(10株)，檢出率也最高(76.9%)。

表1 血流感染CRKP的檢出時間分布

2.2 CRKP的耐藥情況和耐藥基因檢測

51株CRKP對檢測的15種臨床常用抗菌藥物呈廣泛耐藥，對其中的哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和環(huán)丙沙星耐藥率為100%；對阿米卡星、慶大霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率較高，分別為76.5%、90.2%和62.8%；對替加環(huán)素耐藥率較低，為3.9%。藥敏結(jié)果詳見表2。

表2 51株血流感染CRKP菌株的抗菌藥物敏感性結(jié)果[n(%)]

51株CRKP均檢測出blaKPC基因，經(jīng)測序鑒定為blaKPC-2基因，未檢測出blaIMP、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM基因。

2.3 MLST分型

本研究中檢測到4種ST型別，以ST11型為主，共 43株(84.3%)，另有ST15型6株(11.8%)、ST4845型1株及1株新分型，等位基因為 (gapA/infB/mdh/pgi/phoE/rpoB/tonB: 3/3/1/234/1/1/4)。

2.4 PFGE聚類分析

對CRKP的PFGE圖譜進(jìn)行聚類分析，同源性分析樹狀圖見圖1。51株CRKP的PFGE圖譜相似性系數(shù)在62.9%～100%，可分為19個簇(A-S簇)，每簇分別包含1～12個菌株。其中A簇(13.7%)和G簇(23.5%)包含的菌株相對較多，且MLST分型均為ST11型，為優(yōu)勢簇。G簇包含7個型別，G4型為主要克隆菌株。B、C、F、N、O、R、S一株即為一簇，PFGE條帶相似度<85%。存在相似性100%的菌株，PT型分別為A1、G3、G4、L1、M和Q1。

圖1 51株CRKP的PFGE聚類分析

3 討論

KP廣泛存在于環(huán)境中，可定植于物體表面、人體的腸道、呼吸道及皮膚等部位，在引起院內(nèi)感染的革蘭陰性菌中居第2位[2,9]。隨著抗菌藥物被廣泛應(yīng)用，KP耐藥問題日益嚴(yán)峻，全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(China antimicrobial resistance surveillance system, CHINET)數(shù)據(jù)顯示，KP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2019年的25.3%和26.8%[2]。除替加環(huán)素、多黏菌素、頭孢他啶阿維巴坦和氨曲南阿維巴坦等少數(shù)藥物外，CRKP對幾乎所有常用抗菌藥物具有較高的耐藥性，為臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[10]。

本研究中某三甲醫(yī)院分離的CRKP菌株對頭孢菌素類、喹諾酮類和酶抑制劑復(fù)方制劑(頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦)耐藥率達(dá)100%，對復(fù)方新諾明和氨基糖苷類的耐藥率在60%以上，耐藥形勢嚴(yán)峻。研究發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素的耐藥機(jī)制與外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)及單藥治療有關(guān)[11]。本研究中檢出的CRKP菌株對替加環(huán)素耐藥率為3.9%，中介率為5.9%，需警惕其在抗生素壓力下轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幹甑目赡?。臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎、規(guī)范地使用抗生素，合理選擇聯(lián)合用藥方案，并加強(qiáng)對耐藥菌的監(jiān)測。

在我國，KP對碳青霉烯類耐藥的主要原因是碳青霉烯酶的產(chǎn)生，其中KP碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)最為常見，我國主要的流行型別為KPC-2[12]。本研究的51株血標(biāo)本來源的CRKP中，blaKPC-2基因檢出率為100%，與陳君灝等人的研究相符[13]，提示上海地區(qū)有可能存在攜帶blaKPC-2的質(zhì)粒水平傳播。有研究表明，ST11型是我國CRKP的主要型別[14]。 本研究的血流感染CRKP中，ST11型占比達(dá)到84.3%，與文獻(xiàn)報道一致。

僅以耐藥表型和ST型別不足以區(qū)分CRKP菌株間的差異，而PFGE具有重復(fù)性好、分辨力高的優(yōu)點(diǎn)，在分子流行病學(xué)研究中廣泛運(yùn)用，對確定感染來源、追蹤傳播路徑、研究遺傳演變具有重要意義[15]。本研究的PFGE分析顯示，51株CRKP以G簇和A簇為優(yōu)勢群，在2015—2017年均有分布。PFGE結(jié)果顯示有7個簇相似性<85%，無克隆相關(guān)性，為散發(fā)流行，遺傳背景較為多樣，主要為外院帶入和社區(qū)獲得性感染。

本研究中存在6個PFGE型含有2株及以上的菌株，提示該院存在克隆傳播，需重視對耐藥菌的監(jiān)測、識別和追蹤。其中A1型克隆在不同年份、不同病區(qū)檢出，提示某些耐藥克隆具備傳播優(yōu)勢，可在醫(yī)院中廣泛、長期存在，需警惕院內(nèi)感染的暴發(fā)。優(yōu)勢克隆G4型在時間分布上也較為離散，除KP22外均來自ICU。追溯病史發(fā)現(xiàn)KP22從普外科患者血培養(yǎng)標(biāo)本中分離得到，該患者術(shù)后立即進(jìn)入ICU留觀，第2天出現(xiàn)高熱，當(dāng)日送檢的血標(biāo)本與傷口分泌物培養(yǎng)到的KP藥物敏感性試驗表型一致。因此推測，KP22感染與手術(shù)相關(guān)，由患者在ICU獲得，G4型均來自ICU，應(yīng)當(dāng)警惕ICU內(nèi)的克隆傳播，加強(qiáng)術(shù)后感染防控，警惕由于CRKP感染患者更換床位或病房所導(dǎo)致的播散。此外，K1和K2均來自普外科，分離時間接近，相似性達(dá)95%以上，K3更早分離自神經(jīng)外科，相似性為89.3%，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，提示CRKP在傳播中可產(chǎn)生一定程度的遺傳變異。

本研究發(fā)現(xiàn)，3株Q1型菌株(KP31、KP36和KP41)PFGE脈沖型一致，但ST型不同，屬于ST11型和ST15型，2種型別有3個等位基因差異。這可能是由于等位基因所在片段的大小相等或接近，PFGE條帶位置及分析軟件無法區(qū)分，從而造成ST分型和基因分型不一致。同時也提示MLST和PFGE這兩種分子分型方法可以互相補(bǔ)充[16]。

由于2017年上半年CRKP檢出增多，該院執(zhí)行了接觸隔離，加強(qiáng)手衛(wèi)生及環(huán)境消毒，積極采取預(yù)防控制措施[17]，有效控制了CRKP的傳播，2017年下半年CRKP檢出率明顯下降。該院感染科、神經(jīng)外科為優(yōu)勢科室，也是除ICU外CRKP檢出較多的科室，應(yīng)加強(qiáng)重點(diǎn)科室對CRKP的管控，減少危險因素，避免定植現(xiàn)象，切斷細(xì)菌在院內(nèi)的傳播途徑[18]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，所分離的CRKP對臨床多類抗菌藥物呈高度耐藥，攜帶blaKPC-2基因，以ST11型克隆為主，優(yōu)勢基因型別為G4，存在小范圍的暴發(fā)流行和優(yōu)勢克隆的長期傳播。由于本研究僅納入了患者血標(biāo)本分離的CRKP菌株，未對同時期環(huán)境、器物表面及醫(yī)療人員手部進(jìn)行采樣，如能將不同時期、不同病區(qū)分離到的各類標(biāo)本來源菌株和環(huán)境菌株進(jìn)行對比，可以更好地了解該院的院內(nèi)感染情況及對CRKP進(jìn)行追蹤，以防控院內(nèi)感染的發(fā)生。