柴小粉 楊雅菲 張 杰 韓振海 許雪峰 張新忠 吳 婷 王 憶*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，北京 100193; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物營養(yǎng)與生理重點(diǎn)實驗室，北京 100193； 3.北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

蘋果作為世界四大水果之一，是全球食用最廣泛的水果，我國是世界蘋果第一生產(chǎn)大國。2017年我國蘋果種植面積222萬hm2，產(chǎn)量4 139萬t，分別占世界蘋果種植面積和產(chǎn)量的45%和49.78%[1]。與歐美國家種植蘋果的方式有所不同，我國果園管理常以大量化肥的投入作為保持樹體生長和穩(wěn)產(chǎn)增收的保障[1]，而長時間較低的肥料利用效率造成資源浪費(fèi)、土壤理化性質(zhì)改變、生物環(huán)境惡化、樹勢衰弱及產(chǎn)量降低等一系列問題[2-3]。2015年，國家提出“到2020年化肥使用量零增長行動方案”，提出“精、調(diào)、改、替”4條技術(shù)路徑，其中“替”指有機(jī)肥代替化肥的施用。隨著有機(jī)肥料投入比例逐漸增加，通過改善土壤狀況，一定程度上緩解土壤養(yǎng)分不均衡現(xiàn)象，并促進(jìn)植物生長[4-5]。

近年來，隨著微生物的研究發(fā)展，土壤微生物也引起了廣泛的關(guān)注，尤其是土壤微生物與土壤元素相互作用越來越受到人們重視[6-8]。土壤微生物分布受自然因素(地理位置、氣候條件及土壤類型等)[9-10]和人為因素(施肥和種植等)[11]的共同影響。土壤真菌是評價土壤質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一，其活動影響著生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動，以及無機(jī)質(zhì)的分解與有機(jī)質(zhì)的礦化及腐殖化，并在改良土壤肥力和維持生態(tài)系統(tǒng)平衡等方面發(fā)揮作用[12-13]。此外，土壤中存在可以引發(fā)植物病害的真菌[14]，同時也有一些真菌可以作為有益菌促進(jìn)植物生長發(fā)育或抑制病蟲害發(fā)生[15-16]。蘋果樹作為多年生植物，長時間生長在固定條件下，其對元素的選擇性吸收極易造成土壤養(yǎng)分虧缺；同時，根系分泌的小分子物質(zhì)可以作為微生物生長和繁殖的碳源[17]，使得微生物類群富集，影響植物生長[18]。有研究表明，適量有機(jī)肥的施用增加了土壤真菌群落的多樣性[12]，而關(guān)于有機(jī)肥肥施用量和樹齡對土壤真菌變化的研究相對較少。

北京市處在暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，屬于蘋果適宜栽培的區(qū)域，且作為都市型果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的領(lǐng)頭羊，有機(jī)肥施用覆蓋范圍比較廣泛。本研究對北京地區(qū)各果園內(nèi)蘋果真菌菌群組成差異進(jìn)行對比，探討真菌與有機(jī)肥、樹體三者間的關(guān)系，以期為通過調(diào)節(jié)真菌群落組成，減少化肥施用，最終實現(xiàn)改善土壤環(huán)境、增強(qiáng)樹體生長及果實品質(zhì)的目標(biāo)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料方法

1.1 供試材料

試驗果園位于北京市昌平區(qū)(40°15′36″N， 116°13′19″E)，屬于暖溫帶，半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫13 ℃，年均降水量535 mm，降水主要集中在夏季，全年日照2 390 h。該地區(qū)土壤以褐土為主。果園主栽品種為富士，嫁接用基砧為八棱海棠，中間砧為SH系列。本研究包括4個處理：5年樹齡的果園，每棵樹每年分別施用有機(jī)肥35(5M35)和50 kg(5M50)；15年樹齡的果園，每棵樹每年分別施用有機(jī)肥50(15M50)和100 kg(15M100)，有機(jī)肥為牛糞，施肥方式為條施。

1.2 土壤樣品采集

本試驗于2019年8月進(jìn)行取樣，具體取樣方式如下：在果樹樹冠投影內(nèi)緣，避開施肥點(diǎn)，去除表面凋落物，采用“S”采樣方法取0～20 cm的土壤5份混合成一個樣品，每個處理3次重復(fù)。土壤樣品過2 mm篩后分為2份，一份放入干冰之后轉(zhuǎn)移至 -80 ℃ 冰箱，用于微生物的群落分析；另一份自然風(fēng)干，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)測定參照鮑士旦[19]的方法。采用電位法(ISO 10390∶2005)測土壤pH(土水體積比1.0∶2.5)；重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱法測定土壤有機(jī)質(zhì)；堿解擴(kuò)散法測定堿解氮；鉬銻抗比色法測定速效磷；火焰光度計測定速效鉀。

1.4 土壤微生物DNA 提取及測序

土壤DNA提取參照DNA Kit(MoBio Laboratories Inc. Carlsbad, CA, USA)試劑盒說明書。提取的DNA樣本分別用核酸蛋白儀(NanoDrop ND-1000)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測。符合要求的樣本以ITS1-(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)為引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送至北京奧維森基因科技有限公司，利用 Illumina Miseq PE300高通量測序平臺測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel對土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計算。測序數(shù)據(jù)下機(jī)后經(jīng)過QIIME(v1.8.0)軟件過濾、拼接和去除嵌合體。根據(jù)barcodes歸類各處理序列信息聚類為用于物種分類的OTU(Operational Taxonomic Units)，OTU 相似性設(shè)置為97%[20]。對比Silva數(shù)據(jù)庫，得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息[21-22]。利用Mothur 軟件(version 1.31.2)進(jìn)行Alpha多樣分析[23]。經(jīng)過UniFrac算法利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來比較樣品間物種群落差異，并進(jìn)行Beta多樣性分析。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，差異顯著性水平為P<0.05。采用Canoco5進(jìn)行RDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹齡和有機(jī)肥施用量對蘋果園土壤理化性質(zhì)的影響

對選取的試驗果園土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明(表1)：15年樹齡的蘋果園土壤pH顯著低于5年樹齡蘋果園，但相同樹齡的果園有機(jī)肥施用量改變對土壤pH無顯著影響，而果園土壤有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分含量在不同果園土壤之間也存在差異，有機(jī)質(zhì)含量為15M100>15M50>5M50>5M35，土壤堿解氮含量在不同果園之間表現(xiàn)為15M50>15M100>5M35>5M50。說明隨蘋果樹齡增大，果園土壤pH降低，土壤堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量增加，而樹齡相同的果園，有機(jī)肥的施用量對土壤養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量影響較大。

表1 不同蘋果園土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemistry properties of apple orchard

注：數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。每列數(shù)字后不同字母表示在0.05水平上存在顯著差異。5M35,5年樹齡，每棵樹每年施用有機(jī)肥35 kg；5M50,5年樹齡，每棵樹每年施用有機(jī)肥50 kg；15M50,15年樹齡，每棵樹每年施用有機(jī)肥50 kg；15M100,15年樹齡，每棵樹每年施用有機(jī)肥100 kg。下同。

Note: The data are the means ± SE. Values followed by the different letters in each column are significantly different at 0.05 level.5M35 means 5 cultivation years, 35 kg manure per tree per year；5M50 means 5 cultivation years, 50 kg manure per tree per year；15M50 means 15 cultivation years, 50 kg manure per tree per year；15M100 means 15 cultivation years, 100 kg manure per tree per year. The same below.

2.2 種植年限和有機(jī)肥施用量對果園土壤真菌群落多樣性的影響

基于高通量測序結(jié)果，所有土壤真菌Coverage值均>99%，說明該測序結(jié)果代表了果園土壤樣本中真菌的組成。施肥量相同時，種植15年的蘋果園土壤真菌Chao1高于5年果園土壤，而Shannon指數(shù)在不同種植年限果園土壤中未發(fā)生顯著變化(表2)，說明隨著種植年限增加，果園土壤真菌豐富度有所增加。比較而言，有機(jī)肥的施用量對種植幼齡樹(5年)果園的土壤真菌豐富度(Chao 1)有顯著影響，而對于15年樹齡的果園來講，施用量會顯著影響土壤真菌的多樣性(Shannon)(表2)。

2.3 不同處理土壤真菌群落組成

通過數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，最終得到1 307個OTUs，對OTUs在不同分類水平上進(jìn)行注釋，結(jié)果表明蘋果園土壤真菌主要包括7門、21綱、55目和92屬。從門的分類水平看，蘋果園土壤真菌歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、絲足蟲門(Cercozoa)和壺菌門(Chytridiomycota)，其中子囊菌門(39.97%～78.75%)和擔(dān)子菌門(10.25%～49.61%)為蘋果園土壤真菌群落的優(yōu)勢菌種(圖1(a))。

表2 蘋果園土壤真菌Alpha多樣性Table 2 Alpha diversity of fungi in apple orchards

對比不同處理間的差異性發(fā)現(xiàn)，作為優(yōu)勢菌種的子囊菌門和擔(dān)子菌門，其在有機(jī)肥施用量不同的15年樹齡果園土壤中的相對豐度較穩(wěn)定，而在5年樹齡果園的土壤中變化顯著：子囊菌門相對豐度在5M35和5M50果園分別為40.49%和78.75%，擔(dān)子菌門相對豐度在5M35和5M50果園分別為49.61%和10.25%(圖1(a))。說明有機(jī)肥施用量可顯著改變優(yōu)勢菌的分配，子囊菌門相對豐度隨有機(jī)肥施用量增加而增加，擔(dān)子菌則呈現(xiàn)相反趨勢。相對應(yīng)的，有機(jī)肥施用量對15年樹齡果園土壤真菌群落組成的影響則主要體現(xiàn)在非優(yōu)勢菌群(圖1)，尤其是球囊菌，其相對豐度在15M100處理中為0.11%，而在15M50中幾乎不存在(0.009 7%)，另外絲足蟲在15M50和15M100間差異也較大，相對豐度分別為0.31%和0.05%(圖1(b))。

圖1 蘋果園土壤真菌群落組成
Fig.1 Relative abundance of soil fungal community at phyla level

進(jìn)一步從屬水平分析發(fā)現(xiàn)，樹齡和有機(jī)肥施用量對蘋果園土壤真菌群落的組成比例均有影響(圖2)。對得到的OTU進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗發(fā)現(xiàn)，其中86個OTU存在顯著差異，經(jīng)注釋可知這些差異OTU分別歸類在11個屬種，其中Guehomyces屬占比最多，之后依次為沃德霉菌屬Wardomyces、傘菌屬Agaricus、腐質(zhì)霉菌屬Humicola和柄孢殼菌屬Podospora(圖2)。而對優(yōu)勢真菌(RA>1%)在不同果園之間分析發(fā)現(xiàn)(表3)，果園土壤真菌沃德霉菌屬Wardomyces和Guehomyces的相對豐度在不同樹齡和不同有機(jī)肥施用量之間均存在差異，而被孢霉菌屬M(fèi)ortierella相對豐度隨樹齡增加而增加。另外，毛殼菌屬Chaetomium在15M100處理中相對豐度為4.53%，在15M50處理中降低到1.67%，即在成齡果園中，該菌種相對豐度隨有機(jī)肥施用量增加而增加。同樣的，隱球菌屬Cryptococcus在5M50處理中相對豐度為2.32%，在5M35處理中降低到1.40%，即在幼齡果園土壤中，隨有機(jī)肥施用量增加該菌相對豐度降低。而假霉樣真菌屬Pseudallescheria和鐮刀菌屬Fusarium相對豐度在4個處理之間無差異。

圖2 蘋果園土壤真菌前20種屬熱圖
Fig.2 Heatmap of top 20 soil fungal genus in apple orchard

表3 蘋果園土壤真菌屬相對豐度(RA>1%)
Table 3 Relative abundance of fungal dominant genera in apple orchards (RA>1%) %

門Phyla屬Genera處理 Treatment5M355M5015M5015M100Pseudallescheria5.28±0.37 a8.50±0.38 a6.29±0.10 a2.76±0.38 aAscomycotaWardomyces2.95±0.70 a0.13±0.04 b2.15±0.37 a0.49±0.08 bFusarium0.90±0.24 a1.96±0.68 a1.55±0.59 a1.36±0.42 aChaetomium2.15±0.70 ab3.66±0.04 a1.67±0.30 b4.53±0.80 aBasidiomycotaCryptococcus1.40±0.17 b2.32±0.54 a3.11±0.74 a2.29±0.03 abGuehomyces45.32±1.20 a6.37±3.60 c29.83±1.86 b40.88±2.35 aZygomycotaMortierella3.10±0.51 b3.30±0.02 b5.27±0.63 a6.55±0.63 a

2.4 不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對1 307個OTUs進(jìn)行分析通過Venn圖呈現(xiàn)不同樣本組間共有和獨(dú)有OTU數(shù)量。結(jié)果表明所有處理均含有相同的348個OTUs，5M35、5M50、15M50 和15M100獨(dú)有OTU個數(shù)分別為60、112、98和71。共有OTUs的數(shù)量可代表樣本之間的真菌群落組成相似度，15M50和15M100共有總數(shù)(595個OTUs)大于5M35和5M50共有總數(shù)(518個OTUs)(圖3(a))，說明果園樹齡越大，土壤真菌群落的相似度越高。施肥量相同時，種植5和 15年的蘋果園OTU數(shù)量分別為773和827，共有OTU數(shù)量為491，說明不同樹齡果園土壤真菌組成相似度較低，并且土壤真菌豐富度隨樹齡增加而增加(表2)。

基于OTU(97%相似水平)豐度進(jìn)行PCA分析用于反應(yīng)不同處理的差異。果園土壤真菌在OTU水平的PCA分析表明第一主成分和第二主成分對樣本差異的貢獻(xiàn)值分別為58.87%和16.89%，5M35、5M50、15M50和15M100共4組樣品表現(xiàn)為組內(nèi)聚集，組間有明顯的分離(圖3(b))。在第二主成分上4組樣品可以分為2組(5M50、15M100 和5M35、15M50)，表明有機(jī)肥施用量明顯改變了果園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

(a)OTUs的韋恩圖Venn chart of OTUs；(b)主成分分析 Principal component analysis.
圖3 蘋果園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)
Fig.3 Soil fungal structure

2.5 土壤養(yǎng)分對真菌群落的影響

本試驗分析了不同樣本土壤中真菌群落與土壤理化性質(zhì)及蘋果果實品質(zhì)之間的關(guān)系，圖4中點(diǎn)代表樣本，黑色箭頭代表土壤真菌，紅色箭頭代表土壤理化性質(zhì)，棕色箭頭代表果實品質(zhì)(圖4)。真菌與土壤理化性質(zhì)的冗余分析表明(圖4(a))，3種主要的真菌(毛殼菌屬、假霉樣真菌屬和鐮刀菌屬)與土壤速效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量存在正相關(guān)關(guān)系，而與pH呈負(fù)相關(guān)。相反，在蘋果園土壤中，沃德霉菌屬Wardomyces和Guehomyces屬與土壤pH呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷和堿解氮呈負(fù)相關(guān)。微生物與蘋果果實品質(zhì)的冗余分析表明(圖4(b))，毛殼菌屬和假霉樣真菌屬在果實品質(zhì)中的發(fā)揮正向的作用，尤其是可滴定酸和可溶性糖，而沃德霉菌屬Wardomyces和Guehomyces屬均與果實可滴定酸呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

SOM,土壤有機(jī)質(zhì) Soil organic matter; AN,堿解氮 Alkali-hydrolyzable N; AP,速效磷 Available P; AK,速效鉀 Available K
圖4 蘋果園土壤中真菌群落與土壤理化性質(zhì)(a)和蘋果果實品質(zhì)(b)的冗余分析
Fig.4 RDA of soil properties (a), fruit quality (b) and soil fungal dominant genera in apple orchards

北京地區(qū)蘋果種植有機(jī)肥施用范圍較廣泛，通過對不同樹齡和有機(jī)肥施用量的果園土壤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，成齡蘋果園土壤pH低于幼齡果園。有報道表明多年生果園土壤受根系分泌的有機(jī)酸等物質(zhì)影響，pH會隨樹齡增加逐步降低[24]。而成齡蘋果園土壤速效養(yǎng)分含量高于幼齡果園，與姜遠(yuǎn)茂等[25]對山東蘋果園土壤養(yǎng)分狀況調(diào)查結(jié)果趨勢相同。同時，施肥方式對不同樹齡果園土壤真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響不一致[26]，對于幼齡果園，有機(jī)肥的增施對真菌豐富度造成較大的影響，而成齡果園增施的有機(jī)肥在一定程度上增加了土壤肥力，對真菌群落組成并未存在顯著影響。試驗地蘋果園土壤的真菌主要由子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門組成，這與在茶園和枸杞等多年生作物的研究中類似[27-28]。土壤真菌總數(shù)量隨著果樹的樹齡增大而增大，其原因在于植物的生長過程改變了土壤中的菌群組成[29]。子囊菌門和擔(dān)子菌門在幼齡果園受有機(jī)肥施用量的影響更明顯，真菌屬水平分析結(jié)果表明增施有機(jī)肥降低真菌沃德霉菌屬Wardomyces和Guehomyces屬在果園土壤中的相對豐度，而這2種菌與土壤速效養(yǎng)分存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與蘋果可滴定酸也存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。毛殼菌屬在成齡果園中受有機(jī)質(zhì)調(diào)控，并且對果實品質(zhì)有顯著的正向調(diào)控。在生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物參與植物殘體的分解，從而推動土壤中碳、氮循環(huán)過程，是土壤養(yǎng)分循環(huán)的動力[30]。

本研究通過對北京地區(qū)蘋果園內(nèi)土壤真菌組成及其多樣性指數(shù)對比發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)蘋果園內(nèi)的真菌多樣性穩(wěn)定，其中非致病真菌占比較大，可能是因為根系活力隨著樹齡的增大而減弱，細(xì)菌和放線菌的減少增加了真菌的含量，同時根系分泌的酚酸類物質(zhì)增多，長期以往則會造成一些與土傳病害相關(guān)的真菌[31-32](如柱孢屬Cylindrocarpon及鐮刀菌屬Fusarium等)占比增加，從而造成連作障礙的發(fā)生[33-35]。果園土壤中真菌菌群相互制約，存在與植物相關(guān)的促生菌與致病菌，例如：毛殼菌和漆斑菌屬M(fèi)yrothecium等對蘋果黑星病及根結(jié)線蟲雜草等有拮抗作用[36]，而Rhizophagus和木霉菌屬Trichoderma可以與植物互惠共生。但隨著樹齡增加，有益菌占比下降，而致病菌(輪枝菌屬Verticillium、赤霉菌屬Gibberella和莖點(diǎn)菌屬Phoma)增多。

蘋果樹生長過程中需要從土壤中汲取大量的營養(yǎng)元素，因此果園每年投入肥料維持樹體生長，不平衡的肥料施用進(jìn)一步加快了土壤退化的速度，而果園通過有機(jī)肥施用影響了植物與微生物之間的關(guān)系，也降低土壤中有害的酚酸類物質(zhì)，減少作物的自毒作用[37-38]。植物與真菌的互作機(jī)理，以及近半數(shù)功能未知的真菌群落有待進(jìn)一步的研究與分析。今后我們也希望通過對有機(jī)肥的施用以及土壤真菌組成的分析，為今后降低肥料的使用，通過檢測真菌組成監(jiān)測土壤環(huán)境的狀態(tài)及質(zhì)量，以及通過利用菌群間的互作關(guān)系，改變土壤菌群組成，從而改善土壤環(huán)境及樹體長勢，并進(jìn)一步預(yù)測果實品質(zhì)提供有益的參考。