肖敏，郭蓮軍，羅攀

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430014；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030；3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030)

慢性腦缺血往往會導(dǎo)致不可逆性腦損傷，引發(fā)一系列病理性改變。然而，缺血后情感障礙常常被人們忽略。研究表明，急性或慢性腦血管病中約40%患者會出現(xiàn)情感障礙，包括抑郁癥狀及焦慮癥狀[1-2]。情感障礙的產(chǎn)生能延緩疾病的康復(fù)，導(dǎo)致高致殘率和致死率，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。研究顯示，部分經(jīng)典抗抑郁藥并不適合缺血后治療[3]，所以尋求有效的藥物對缺血后情感障礙進行干預(yù)十分必要。

巴氯芬是一種γ-氨基丁酸亞型B(gamma-amino butyric acid type B，GABAB)受體激動藥，臨床上主要用作一些腦部或脊髓疾病繼發(fā)的肌肉痙攣或強直的肌肉松弛藥。近年來，隨著研究的深入，巴氯芬在多種病理狀況下顯示出較好的治療潛力[4-5]。有研究指出巴氯芬對抑郁和焦慮癥狀也具有一定的改善作用[6-7]。然而，巴氯芬能否改善慢性腦缺血所致的情感障礙，以及其所涉及的分子機制，目前尚未研究清楚。

本研究通過雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(two-vessel occlusion，2VO)建立大鼠慢性腦缺血模型，評價巴氯芬對缺血后大鼠焦慮樣癥狀及抑郁樣癥狀的改善作用。杏仁核是負責情感加工最重要的一個腦區(qū)。有研究指出2VO 造模后可導(dǎo)致杏仁核局部腦血流量降低及神經(jīng)元損傷[8-9]。所以本研究進一步基于杏仁核探討其作用的分子機制，并在細胞模型上進行論證。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 巴氯芬(上海邁瑞爾化工科技有限公司，批號：1134-47-0)，腦源性神經(jīng)因子(brain-derived nerve factor，BDNF)抗體(Santa Cruz Biotechnology，批號：sc-20981)，TrkB抗體(ABclonal Technology，批號：A2099)，GAPDH(CWbiotech，批號：CW010)，BDNF酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(CSB-E04504r-1，Cusabio)，凝膠電泳儀(DYY-8C，北京六一儀器廠)，酶標儀(Elx800，Bio2tek)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco，批號：10099-141)，伊格爾改良培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，Hyclone，批號：SH30022.01)。其余試劑均為市售分析純。

1.2實驗動物、細胞及分組 實驗操作過程均遵循國際衛(wèi)生研究機構(gòu)關(guān)于動物使用倫理學(xué)方面的原則。清潔級 SD大鼠，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂) 2010-0009，體質(zhì)量約200 g，隨機分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。環(huán)境溫度保持在23～25 ℃，光照遵循自然節(jié)律。通過簡單隨機化分組，分為假手術(shù)組(n=12)，2VO缺血組(n=16)，2VO+巴氯芬組(n=16)，假手術(shù)+巴氯芬組(n=12)。巴氯芬給藥劑量為25 mg·kg-1(溶于0.9% 氯化鈉溶液中)，腹腔注射，持續(xù)給藥3周，參考文獻[10]，實驗流程見圖1。

實驗用人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自美國菌種保藏中心。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃含5% 二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中養(yǎng)。實驗分為正常對照組，氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型對照組，OGD+巴氯芬小劑量組(50 μmol·L-1)，OGD+巴氯芬中劑量組(100 μmol·L-1)，OGD+巴氯芬大劑量組(200 μmol·L-1)。

1.3大鼠2VO手術(shù)與細胞OGD模型 大鼠麻醉后將體溫維持在36～38 °C，將兩側(cè)頸總動脈與迷走神經(jīng)分離。之后對雙側(cè)頸總動脈進行雙結(jié)扎，并在兩個結(jié)扎點之間剪斷。假手術(shù)組大鼠只分離頸總動脈，不結(jié)扎和剪斷血管。SH-SY5Y細胞培養(yǎng)過程中將氧氣用氮氣替換，并用無糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)建立OGD模型。分別OGD 4及8 h。巴氯芬在OGD前5 min與細胞共孵育。

1.4焦慮樣行為評價

1.4.1曠場實驗 曠場實驗裝置是由一個100 cm×100 cm×40 cm的黑色敞箱組成，該敞箱上方放置一個數(shù)碼攝像頭，并連接到EthoVision分析系統(tǒng)(Noldus信息技術(shù)公司)。大鼠從敞箱中間放入，攝像頭記錄大鼠5 min內(nèi)的活動情況并進行分析。以大鼠運動總路程評價其自發(fā)活動，大鼠在中心區(qū)域所待時間評價其焦慮癥狀。

1.4.2十字迷宮實驗 高架十字迷宮裝置是由兩個開放臂(50 cm×10 cm)、兩個閉合臂(50 cm×10 cm×30 cm)以及一個中央?yún)^(qū)域(10 cm×10 cm)組成十字形裝置，該裝置離地面50 cm。大鼠從裝置中央?yún)^(qū)域放入，記錄5 min內(nèi)大鼠進入開放臂的次數(shù)和停留的時間，大鼠活動記錄和分析系統(tǒng)與曠場實驗相同。

1.5抑郁樣行為評價

1.5.1糖水偏好實驗 整個實驗過程分為3個階段：適應(yīng)階段，基準值檢測階段，以及糖水偏好檢測階段。大鼠在造模前進行糖水適應(yīng)及基準值檢測：將大鼠每日攝取的自來水換成1%蔗糖溶液，適應(yīng)24 h。隨后將大鼠分籠飼養(yǎng)，配對放置兩個外形一樣的分別含1%蔗糖的水瓶和自來水水瓶，檢測期間水瓶位置相互更換一次。記錄72 h內(nèi)每只大鼠分別攝入的糖水量和自來水量。糖水偏好率=[糖水飲用量/(糖水飲用量+自來水飲用量)]×100%。大鼠造模后第33天進行糖水偏好檢測，操作同基準值檢測。檢測24 h內(nèi)大鼠的糖水偏好率。

圖1 實驗流程圖

1.5.2強迫游泳實驗 強迫游泳實驗裝置由一個高60 cm、直徑20 cm的透明有機玻璃圓桶組成。圓桶注入水，溫度為(25±2) ℃，深度為40 cm。實驗前一天，大鼠放入圓桶中預(yù)適應(yīng)10 min，實驗當天大鼠再次放入圓桶中，記錄5 min內(nèi)大鼠的累積不動時間。

1.6Western blotting檢測蛋白含量 分離各組大鼠杏仁核組織，提取總蛋白。取等量蛋白進行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后，4 ℃孵育一抗(BDNF及TrkB)12 h。第2天清洗后加入相應(yīng)二抗孵育2 h。洗滌后，加入顯影液顯影成像。使用GAPDH抗體進行內(nèi)參校正。曝光圖像用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。

1.7ELISA分析 收集OGD后各組細胞上清液，按照BDNF ELISA試劑盒說明書進行檢測。96孔板中每孔加入待測樣本100 μL，然后依次加入一抗工作液(50 μL，120 min)，酶標抗體工作液(100 μL，60 min)，底物工作液(100 μL，10 min，避光)。加入終止液100 μL后，30 min內(nèi)用酶標儀在波長450 nm處測吸光度值。之后根據(jù)標準曲線轉(zhuǎn)換成各孔BDNF的濃度。每組設(shè)副孔2個，實驗重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠焦慮樣癥狀 結(jié)果見表1。曠場實驗顯示2VO及巴氯芬不影響大鼠的運動總路程，提示其自發(fā)活動不受影響。然而單因素方差分析結(jié)果顯示大鼠在中央?yún)^(qū)域所待時間組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.65，P<0.01)。2VO后大鼠在中央?yún)^(qū)域所待時間明顯縮短(與假手術(shù)組比較，P<0.05)，給予巴氯芬后能延長2VO所致的中央?yún)^(qū)域所待時間(與2VO模型對照組比較，P<0.05)。單因素方差分析結(jié)果顯示高架十字迷宮實驗中大鼠在開放臂所待時間組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.66，P<0.05)。與假手術(shù)組比較，2VO后大鼠在開放臂所待時間明顯縮短(P<0.05)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬后大鼠在開放臂所待時間顯著延長(P<0.05)。提示巴氯芬能改善慢性腦缺血所致的焦慮樣癥狀。

表1 4組大鼠焦慮樣行為評價結(jié)果

組別大鼠/只曠場實驗運動總路程/cm中央?yún)^(qū)域所待時間/s高架十字迷宮實驗開放臂所待時間/s假手術(shù)組121 014.11±79.5322.36±2.4657.15±4.392VO模型對照組161 046.57±68.2915.70±1.83①42.61±3.67①2VO+巴氯芬組16960.36±78.4421.05±1.35②53.88±3.12②假手術(shù)+巴氯芬組12897.63±103.9526.13±2.6049.68±5.04

①與假手術(shù)組比較，t=2.31，2.55，P<0.05；②與2VO模型對照組比較，t=2.02，2.13，P<0.05。

①Compared with sham operation group，t=2.31，2.55，P<0.05；②Compared with 2VO model group，t=2.02，2.13，P<0.05.

2.2巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠抑郁樣癥狀 結(jié)果見表2。在2VO手術(shù)前各組大鼠的糖水偏好率無明顯差異；而2VO手術(shù)后，單因素方差分析結(jié)果顯示糖水偏好率組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.92，P<0.05)。 與假手術(shù)組比較，2VO大鼠糖水偏好率明顯降低(P<0.01)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬干預(yù)2VO大鼠糖水偏好率的下降能得到改善(P<0.05)。同樣，強迫游泳實驗單因素方差分析結(jié)果顯示不動時間組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.69，P<0.05)，與假手術(shù)組比較，2VO后大鼠的累積不動時間顯著延長(P<0.05)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬后能緩解該時間的延長(P<0.05)。提示巴氯芬能改善慢性腦缺血所致的抑郁樣癥狀。

表2 4組大鼠抑郁樣行為評價結(jié)果

組別大鼠/只糖水偏好實驗基準糖水偏好率/%檢測糖水偏好率/%強迫游泳實驗累積不動時間/s假手術(shù)組1293.76±1.6490.99±2.2028.58±3.632VO模型對照組1693.05±1.3173.17±5.88①45.19±5.12②2VO+巴氯芬組1692.88±1.8186.01±4.01③32.69±3.17③假手術(shù)+巴氯芬組1291.93±1.5984.68±3.8632.17±6.28

①與假手術(shù)組比較，t=2.76，P<0.01；②與假手術(shù)組比較，t=2.51，P<0.05；③與2VO模型對照組比較，t=2.15，2.05，P<0.05。

①Compared with sham operation group，t=2.76，P<0.01；②Compared with sham operation group，t=2.51，P<0.05；③Compared with 2VO model control group，t=2.15，2.05，P<0.05.

2.3巴氯芬改善慢性腦缺血大鼠杏仁核中BDNF及TrkB蛋白表達的下調(diào) 慢性腦缺血后大鼠杏仁核中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及受體TrkB的表達見圖2 。單因素方差分析顯示：BDNF組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.54，P<0.05)，TrkB組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.38，P<0.05)。 與假手術(shù)組比較，2VO手術(shù)后大鼠杏仁核中BDNF及TrkB的表達顯著下調(diào)(BDNF：t=2.99，P<0.01，TrkB：t=2.44，P<0.05)；與2VO模型對照組比較，給予巴氯芬干預(yù)后能緩解杏仁核中BDNF及TrkB的表達下調(diào)(BDNF：t=2.43，P<0.05，TrkB：t=2.39，P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.2VO模型對照組；C.2VO+巴氯芬組；D.假手術(shù)+巴氯芬組。①與假手術(shù)組比較，t=2.99，P<0.01；②與2VO模型對照組比較，t=2.43，2.39，P<0.05；③與假手術(shù)組比較，t=2.44，P<0.05。

A.Sham group；B.2VO model group；C.2VO+ baclofen group；D.Sham operattion baclofen group；①Compared with sham operattion group，t=2.99，P<0.01；② Compared with the 2VO model group，t=2.43，2.39，P<0.05； ③Compared with sham operattion group，t=2.44，P<0.05.

2.4巴氯芬改善SH-SY5Y細胞OGD后BDNF分泌的減少 為進一步探討巴氯芬對缺血后BDNF的影響，采用ELISA實驗技術(shù)在細胞水平上檢測了不同劑量巴氯芬對OGD處理后SH-SY5Y細胞BDNF分泌的影響。結(jié)果見表3。單因素方差分析顯示OGD 4 h組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.10，P<0.05)，OGD 8 h組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.21，P<0.01)。與正常對照組比較，OGD后SH-SY5Y細胞BDNF的分泌顯著減少(OGD 4 h：P<0.05；OGD 8 h：P<0.01)；與OGD模型對照組比較，給予巴氯芬中、大劑量能顯著抑制SH-SY5Y細胞BDNF分泌減少(P<0.05或P<0.01)。

表3 5組SH-SY5Y細胞BDNF含量比較

組別OGD 4 hOGD 8 h正常對照組1.00±0.061.00±0.04OGD模型對照組0.82±0.05①0.69±0.02②OGD+巴氯芬 小劑量組0.85±0.020.74±0.03 中劑量組0.96±0.05③0.79±0.02③ 大劑量組1.01±0.03④0.81±0.03③

①與正常對照組比較，t=2.89，P<0.05；②與正常對照組比較，t=6.93，P<0.01；③與OGD模型對照組比較，t=2.31，2.14，2.77，P<0.05；④與OGD模型對照組比較，t=3.10，P<0.01。

①Compared with the normal control group，t=2.89，P<0.05； ② Compared with the normal control group，t=6.93，P<0.01； ③Compared with the OGD model group，t=2.31，2.14，2.77，P<0.05； ④Compared with the OGD model group，t=3.10，P<0.01.

3 討論

近年來，腦缺血后情感障礙的產(chǎn)生越來越引起重視。研究表明改善腦缺血后焦慮或者抑郁癥狀對腦缺血的預(yù)后治療非常重要[11]。所以尋找有效的藥物對腦缺血后情感障礙進行干預(yù)十分必要。

曠場實驗和高架十字迷宮實驗是評價動物焦慮樣行為最常用的方法。抑郁樣癥狀最主要的表現(xiàn)特征是快感缺乏和行為絕望，動物實驗中分別常用糖水偏好實驗和強迫游泳實驗評價。通過以上行為學(xué)實驗檢測發(fā)現(xiàn)，巴氯芬能改善慢性腦缺血后大鼠出現(xiàn)的焦慮樣與抑郁樣癥狀。這與之前文獻報道巴氯芬對多種模型的抑郁或焦慮癥狀有改善作用相一致[6-7]。巴氯芬的藥理作用主要與其激活GABAB受體有關(guān)。事實上，其他 GABAB受體的激活劑或變構(gòu)調(diào)節(jié)劑也被報道對抑郁或焦慮癥狀有改善作用[12- 13]。神經(jīng)營養(yǎng)假說是情感障礙發(fā)生最重要的一種假說。研究表明：BDNF可能是連接情感障礙與心腦血管疾病之間的橋梁[14]。而GABAB受體對神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的分泌起重要調(diào)控作用[15]，給予巴氯芬也被證實能促進多種神經(jīng)營養(yǎng)因子包括BDNF的分泌和表達[16]。這與本研究結(jié)果巴氯芬能上調(diào)缺血后大鼠杏仁核BDNF及其受體TrkB的表達相對應(yīng)。提示巴氯芬可能通過作用BDNF-TrkB信號通路改善腦缺血后情感障礙的產(chǎn)生。

綜上所述，巴氯芬可改善慢性腦缺血引起的焦慮樣癥狀和抑郁樣癥狀，其機制可能是通過作用于BDNF-TrkB信號通路而發(fā)揮的。并且巴氯芬作為GABAB受體激動劑有望同時改善腦缺血引起的興奮抑制失衡，使其對腦缺血后的治療更具優(yōu)勢。