陸海濤，郭健，劉利君，牛艷東，段昕所

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚性病科，承德 067000)

皮膚黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，源于外胚層神經(jīng)嵴分化而來的黑素細(xì)胞，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[1]，目前的治療效果欠佳[2]。順鉑(cisplatin，CDDP)是治療多種腫瘤的一線用藥，對于腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用[3]，但是在腫瘤化療中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象[4-5]已明顯削弱其療效，解決抗腫瘤藥物的耐藥問題具有重大臨床意義。腫瘤的基因治療越來越受到關(guān)注，研究表明，T-鈣黏蛋白(T-cadherin)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[6]，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[7-8]。筆者擬建立對順鉑耐藥的黑色素瘤細(xì)胞株(CDDP-R B16F10)，構(gòu)建T-鈣黏蛋白的真核表達(dá)載體，將T-鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)染黑色素瘤順鉑耐藥株，觀察T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對黑色素瘤順鉑耐藥株的影響。

1 材料與方法

1.1材料 黑色素瘤B16F10細(xì)胞株由白求恩醫(yī)科大學(xué)提供。順鉑(美國Sigma公司，批號：MKBV3446V，含量≥99.9%)，TRIzol：(美國Invitrogen公司，批號：15596026)，脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司，批號：11668027)，噻唑藍(lán)(MTT，美國Sigma 公司)，增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-N1，美國Invitrogen公司)，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物公司)，G418(Promega 公司)，免疫組化用T-鈣黏蛋白一抗(美國Santa Cruz公司)，免疫組化用T-鈣黏蛋白二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，碘化丙啶(propidium iodide，PI，美國Sigma公司)，DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.2CDDP-R B16F10的建立 采用大劑量沖擊及逐步增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)，使B16F10細(xì)胞能夠在含有4 mg·L-1順鉑的RPMI-1640培養(yǎng)基中正常生長，命名為CDDP-R B16F10細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)法檢測獲得性耐藥對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，實驗分2組，即CDDP-R B16F10細(xì)胞組和B16F10組(對照組)，腫瘤細(xì)胞接種于24孔板，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×104個，每日計數(shù) 5 個孔的細(xì)胞，連續(xù)計數(shù)4 d后繪制生長曲線，根據(jù) Patterson公式計算倍增時間。MTT法測定CDDP-R B16F10對順鉑的敏感性，實驗分3組，分別為CDDP-R B16F10+CDDP組(培養(yǎng)基為含4 mg·L-1順鉑的RPMI-1640培養(yǎng)基)、B16F10+CDDP組(培養(yǎng)基為含4 mg·L-1順鉑的RPMI-1640培養(yǎng)基)、B16F10組(無順鉑，培養(yǎng)基為不含順鉑的正常RPMI-1640培養(yǎng)基)，細(xì)胞以2×105·mL-1的密度接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，每日各組測定5個孔的吸光度(A)值，繪制生長曲線。

1.3T-鈣黏蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建 據(jù)Gene Bank(NM_001257)設(shè)計2條引物，上游引物為5′-CCGGAATTCATGCAGCCGAGAACTCCGCT-3′，下游引物為5′-CGCGGATCCTCACAGACAAGCTAAGCTGAA-G-3′，下劃線處分別為EcoR I和BamH I酶切位點，以TRIzol 一步法提取人子宮平滑肌組織的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、擴增、回收純化后將其和pEGFP-N1用 EcoR I和BamH I分別進(jìn)行雙酶切，采用T4 DNA連接酶將目的基因片段連入線性化的pEGFP-N1真核表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌Top10，挑選單個陽性菌落接種于液體肉湯培養(yǎng)基，小量提取、限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I酶切鑒定，送檢測序，證實pEGFP-N1-T-cadherin載體構(gòu)建成功。

1.4T-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10細(xì)胞、篩選及鑒定 應(yīng)用LipofectamineTM2000將pEGFP-N1-T-cadherin及pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10細(xì)胞，pEGFP-N1質(zhì)粒攜帶G418抗性基因，G418進(jìn)行篩選，2周后獲得可穩(wěn)定表達(dá)T-鈣黏蛋白的CDDP-R B16F10細(xì)胞。采用有限稀釋法挑選轉(zhuǎn)染成功的單個細(xì)胞，反復(fù)篩選和傳代，挑選在抗性培養(yǎng)基中生長良好的細(xì)胞作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將細(xì)胞分3組，分別為未轉(zhuǎn)染基因的CDDP-R B16F10細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體的CDDP-R B16F10細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin 的CDDP-R B16F10細(xì)胞，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法檢測各組T-鈣黏蛋白的表達(dá)情況。

1.5MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況 實驗分6組，分別為CDDP-R B16F10組(空白對照組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體的CDDP-R B16F10組(pEGFP-N1組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin 的CDDP-R B16F10組(pEGFP-N1-T-cadherin組)、順鉑組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體聯(lián)合順鉑的CDDP-R B16F10組(pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑的CDDP-R B16F10組(pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組)?？瞻讓φ战M、pEGFP-N1組和pEGFP-N1-T-cadherin組的培養(yǎng)基為正常RPMI-1640培養(yǎng)基；順鉑組、pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組和pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組的培養(yǎng)基為含4 mg·L-1CDDP的RPMI-1640培養(yǎng)基，采用MTT法，酶標(biāo)儀波長490 nm處測各孔A值。

1.6流式細(xì)胞儀PI染色法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況 實驗分組同前，取細(xì)胞2×106個，制成單細(xì)胞懸液，磷酸鹽/檸檬酸鹽作為緩沖液，PI染色，流式細(xì)胞儀上檢測，觀察凋亡峰情況。

2 結(jié)果

2.1CDDP-R B16F10的增殖能力及其對順鉑的敏感性 細(xì)胞計數(shù)法結(jié)果顯示，在不含有順鉑的培養(yǎng)液中，CDDP-R B16F10和B16F10的增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CDDP-R B16F10和B16F10的倍增時間分別為25.2和23.7 h(P>0.05)，結(jié)果見圖1。MTT法結(jié)果顯示，在含4 mg·L-1順鉑的培養(yǎng)基中，與B16F10+CDDP組比較，第1天CDDP-R B16F10+CDDP組的A值無顯著改變(LSD-t=0.24，P>0.05)；第2，3，4天時，CDDP-R B16F10+CDDP組的A值均高于B16F10+CDDP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=2.48，11.10，17.94，P<0.05)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，同不含順鉑的正常培養(yǎng)基B16F10(無CDDP)組相比，含4 mg·L-1順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)的CDDP-R B16F10+CDDP組A值無顯著改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖2。

2.2轉(zhuǎn)染后CDDP-R B16F10細(xì)胞T-鈣黏蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin和pEGFP-N1空載體的細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)。免疫組化SP法結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin的CDDP-R B16F10細(xì)胞，T-鈣黏蛋白呈陽性表達(dá)；其他兩組呈陰性表達(dá)，見圖3。

圖1 獲得性耐藥對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

Fig.1Theeffectofacquieddrug-resistanceontheproliferationoftumorcells

圖2 CDDP-R B16F10對順鉑的敏感性

Fig.2ThesensitivityofCDDP-RB16F10tocisplatin

2.3T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10細(xì)胞增殖的影響 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑可抑制耐藥細(xì)胞的增殖(P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.4T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10細(xì)胞凋亡的影響 空白對照組、pEGFP-N1組、pEGFP-N1-T-cadherin組、順鉑組、pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組、pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組的凋亡率分別為(0.74±0.21)%，(0.58±0.37)%，(6.23±1.70)%，(0.67±0.38)%，(0.72±0.30)%，(19.43±2.52)%。pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組的凋亡率明顯高于其他各組(F=105.991，P<0.05)。pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組可見明顯的亞倍體峰，T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑可促進(jìn)CDDP-R B16F10的凋亡(P<0.05)，見圖4。

3 討論

黑色素瘤是皮膚癌中侵襲性最強的類型，其最突出的特點是對放療、化療的不敏感以及外部刺激可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒性藥物，作為傳統(tǒng)的抗腫瘤藥，順鉑已出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。目前認(rèn)為，藥物去活作用增強，DNA損傷修復(fù)異常，藥物攝取異常，細(xì)胞凋亡通路及一些間接信號通路的變化等可能與順鉑耐藥有關(guān)。鈣黏蛋白作為黏附分子中一個超家族，可介導(dǎo)鈣依賴的細(xì)胞間黏附，在多種腫瘤的增殖、遷移過程中起重要的作用，上調(diào)某些鈣黏蛋白分子可提高腫瘤對化療藥物的敏感性[9]。T-鈣黏蛋白分子屬于鈣黏蛋白超家族，因其缺少跨膜區(qū)而以糖基磷脂酰肌醇分子在細(xì)胞膜上附著而得名。研究表明，T-鈣黏蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]，已在人類多種惡性腫瘤中檢測到T-鈣黏蛋白的表達(dá)缺失[11-13]。

本研究首先建立黑素瘤順鉑耐藥株(CDDP-R B16F10)，然后檢測了CDDP-R B16F10的增殖能力，結(jié)果顯示獲得性耐藥不影響腫瘤細(xì)胞的增殖速度。進(jìn)一步采用MTT法檢測CDDP-R B16F10對順鉑的敏感性，在含4 mg·L-1順鉑的培養(yǎng)基中，第2，3，4天時CDDP-R B16F10細(xì)胞的A值高于B16F10細(xì)胞，說明CDDP-R B16F10細(xì)胞對順鉑的敏感性低于B16F10細(xì)胞，獲得了對順鉑的耐藥性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將構(gòu)建的T-鈣黏蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10，發(fā)現(xiàn)T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑可抑制耐藥腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

A.未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞，T-鈣黏蛋白呈陰性表達(dá)；B.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體的細(xì)胞，T-鈣黏蛋白呈陰性表達(dá)；C.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin的細(xì)胞，T-鈣黏蛋白呈陽性表達(dá)。

圖3 免疫組化SP法檢測轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白的表達(dá)(×200)

A.The negative expression of T-cadherin in un-transfected cells；B.The negative expression of T-cadherin in blank vector transfectants；C.The positive expression of T-cadherin in pEGFP-N1-T-cadherin cells.

Fig.3T-cadherinexpressiondetectededbySPimmunohistochemistryaftertransfection(×200)

表1 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10細(xì)胞增殖的影響

組別A值抑制率/%空白對照組1.17±0.09①-pEGFP-N1組1.22±0.13①-pEGFP-N1-T-cadherin組0.88±0.09①24.8順鉑組1.23±0.08①-pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組1.15±0.07①-pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組0.45±0.1161.5F57.732P<0.05

①與pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組比較，P<0.05。

①Compared with pEGFP-N1-T-cadherin combined with cisplatin group，P<0.05.

Bcl-2家族蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)蛋白。研究表明，上調(diào)Bcl-2可提高腫瘤的耐藥性[14]，劉賢奎等[15]將Bcl-2基因轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Bcl-2的高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥性，Bcl-2可導(dǎo)致順鉑耐藥性的產(chǎn)生[16]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣黏蛋白可負(fù)向調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)[17]，作為鈣黏蛋白超家族的一員，T-鈣黏蛋白分子亦可下調(diào)Bcl-2的表達(dá)[6]。將T-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)染黑色素瘤順鉑耐藥細(xì)胞株后，可能通過調(diào)控Bcl-2的表達(dá)，從而實現(xiàn)順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)。

T-鈣黏蛋白可拮抗PI3K/Akt信號通路[6]。PI3K/Akt通路是經(jīng)典的抑制細(xì)胞凋亡的信號通路之一，該信號通路的異常也參與順鉑的耐藥[18]，可通過補償順鉑引發(fā)的致死信號從而抑制細(xì)胞凋亡[19]。p-Akt1在順鉑耐藥的腫瘤組織中呈高表達(dá)，Akt1的擴增可通過mTOR/ p70s6k通路發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞株對順鉑的耐藥作用[20]。筆者推測，T-鈣黏蛋白在CDDP-R B16F10的重新表達(dá)，可能通過該通路導(dǎo)致順鉑耐藥，也可能同通過該通路下游底物及效應(yīng)因子如Bcl-2、survivin、CSE等[21]，最終逆轉(zhuǎn)了耐藥細(xì)胞株對順鉑的耐藥性。

A.空白對照組；B.pEGFP-N1組；C.pEGFP-N1-T-cadherin組；D.順鉑組；E.pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組；F.pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組。

圖4 6組細(xì)胞的凋亡峰

A.Blank control group；B.pEGFP-N1 group；C.pEGFP-N1-T-cadherin group；D.Cisplatin group;E.pEGFP-N1 combined with cisplatin group;4F.pEGFP-N1-T-cadherin combined with cisplatin group.

Fig.4Apoptoticpeakinsixgroupsofcells

綜上所述，腫瘤細(xì)胞獲得順鉑耐藥性的途徑是多方面的，且十分復(fù)雜。T-鈣黏蛋白可能同時針對多種不同的耐藥機制，最終實現(xiàn)順鉑耐藥性的逆轉(zhuǎn)。T-鈣黏蛋白逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的具體機制，以及T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑后所表現(xiàn)出的抗腫瘤作用，有待進(jìn)一步研究。