王曉霞，聶智華，馬力通，崔金龍，賽華征，趙文淵

1. 內(nèi)蒙古科技大學化學與化工學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010 2. 清華大學生命科學學院，北京 100084

引 言

美滿霉素對革蘭氏陽性菌、鏈球菌等均高度敏感。牛血清白蛋白是血液的主要成分，能結合和運輸外源性與內(nèi)源性物質(zhì)，維持血液正常的滲透壓，具有pH緩沖作用、載體作用[1-2]。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的氨基酸序列具有高度同源性，成本較低，因此用BSA替代HSA研究藥物在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程。

目前，光譜法被廣泛應用于藥物活性成分與血清白蛋白結合作用研究中。Samima Karina等[3]利用光譜法研究甲巰丙脯酸與牛血清白蛋白的相互作用； Leila Khalili等[4]用熒光光譜法研究了牛血清白蛋白與植物中提取的阿魏酮之間相互作用的機理。本工作在模擬生理條件下，研究BSA和MC之間相互作用的機理，利用熒光光譜法和紫外-可見吸收光譜法確定了BSA和MC的主要作用力和結合距離，使用同步熒光光譜法、三維熒光光譜法和圓二色譜法觀察了MC對BSA構象的影響，通過分子對接模擬的方法預測了MC和BSA的作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(LS-55，美國PerkinElmer公司)； 紫外分光光度計(SPECORD50，德國耶拿分析儀器股份公司)； 圓二色光譜儀(Jasco-715，北京國嘉恒業(yè)科學儀器有限公司)。

三(羥甲基)氨基甲烷[Tris (hydroxymethyl) aminomethane，Tris，天津市華東試劑廠]； 配置成pH 7.40 的Tris-HCL緩沖液； 美滿霉素(Minocycline，MC，中國食品藥品檢定研究院) ： 1.0×10-3mol·L-1標準儲備液； 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，美國sigma公司)5.0×10-6mol·L-1標準液： 用含0.5 mol·L-1的NaCl的Tris-HCL緩沖液定容配制。

實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 在不同的溫度下MC與BSA的熒光光譜、同步熒光光譜測定、三維熒光光譜測定

溶液中MC的濃度為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1，分別在(298±0.1)，(303±0.1)和(308±0.1) K的恒溫振蕩器中振蕩20 min，分別對不同溫度下的溶液進行熒光發(fā)射光譜、同步熒光光譜掃描。熒光參數(shù)設置如下： 激發(fā)波長280 nm，掃描速度為1 500 nm·min-1，狹縫寬度9 nm，記錄波長范圍在290～550 nm時的熒光發(fā)射光譜。在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下，掃描同步熒光光譜。在激發(fā)波長為200～500 nm，發(fā)射波長200～500 nm范圍內(nèi)進行三維熒光掃描，掃描速度1 500 nm·min-1。

1.2.2 MC與BSA在不同溫度下的紫外光譜測定

溶液中MC的濃度為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1。用二次蒸餾水作對照參比，分別在(298±0.1)，(303±0.1)和(308±0.1) K的恒溫振蕩器中振蕩20 min后進行紫外測量，吸收波長選擇在190～400 nm。

1.2.3 MC與BSA圓二色譜測定

溶液中BSA樣品濃度為1.0×10-5mol·L-1，MC濃度為1.0×10-5和5.0×10-5mol·L-1。掃描范圍為190～250 nm，掃描時間為0.5 s，石英樣品池的光程為0.1 cm，掃描速度為3.3 nm·s-1，靈敏度為2 mdeg·cm-1，分辨率為0.1 nm，測量時MC與BSA的濃度比為1∶0，1∶1，5∶1，并且以Tris-HCL緩沖液作為參比，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過4次掃描取平均值。

1.2.4 分子對接模擬

BSA晶體結構取自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http: //www.rcsb.org/pdb/ home/home.do)，由Chem3D Pro 14.0軟件得到MC的分子結構式，利用軟件Pymol verSion1.8.2.0.進行分子對接模擬。

2 結果與討論

2.1 MC與BSA的熒光猝滅光譜及作用機制的確定

通常蛋白質(zhì)分子可以吸收紫外光并發(fā)射熒光，據(jù)此可定量檢測蛋白質(zhì)，同時，測量所產(chǎn)生的熒光強度可用于蛋白質(zhì)相關作用的研究。圖1為298 K溫度下不同濃度的MC與一定濃度的BSA作用熒光發(fā)射光譜圖，BSA在激發(fā)波長280 nm處，在發(fā)射波長346 nm處產(chǎn)生最大熒光發(fā)射峰。從圖1中可以看到，隨著MC濃度的逐漸增加，BSA的熒光強度呈規(guī)律性下降，但發(fā)射峰的位置基本沒有發(fā)生變化，說明MC對BSA的熒光具有猝滅作用。

圖1 298 K溫度下MC-BSA體系相互作用的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of MC-BSAinteraction system under 298 K

cBSA=5.0×10-7mol·L-1；cMC(1—10)： (0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1； pH 7.40

采用Stern-Volmer[5]方程式確定MC對BSA的猝滅作用機制，方程描述為

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式(1)中F0為未加入猝滅劑(MC)時的熒光強度；F為加入猝滅劑(MC)后的熒光強度；KSV為Stern-Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)；Q為猝滅劑(MC)的濃度；Kq是雙分子猝滅速率常數(shù)； 各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光粹速率常數(shù)約為2.0×1010L·(mol·s)-1；τ0是猝滅劑不存在下生物大分子的平均壽命為10-8s[6]。

本實驗研究MC在298，303和308 K這3種溫度下對BSA的熒光猝滅情況，以F0/F對[Q]作圖，得到Stern-Volmer曲線，計算結果見表1。從表1可看出，隨著溫度升高，MC-BSA體系的熒光猝滅常數(shù)KSV下降，表明MC對BSA過程符合靜態(tài)猝滅特征，Kq值遠遠大于2.0×1010L·(mol·s)-1，進一步證明MC對BSA的熒光猝滅方式是靜態(tài)猝滅。

表1 Stern-Volmer線性方程和相關系數(shù)以及結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)nTable 1 Stern-Volmer linear equations and correlation coefficients plus binding constants KA and binding sites n

2.2 MC與BSA作用的結合常數(shù)和結合位點數(shù)

由于MC對BSA的熒光猝滅方式為靜態(tài)猝滅，利用靜態(tài)猝滅雙對數(shù)公式[7]計算結合常數(shù)和結合位點數(shù)

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中：KA為MC與BSA的結合常數(shù)，n為MC與BSA的結合位點數(shù)。根據(jù)得到的直線斜率和截距可以得到不同溫度下MC與BSA的結合位點數(shù)n和結合常數(shù)KA，見表1。由表1可見，結合常數(shù)KA值都在107數(shù)量級，說明MC對BSA結合形成較穩(wěn)定的復合物，結合位點接近1，說明MC與BSA為1∶1結合類型。

2.3 MC與BSA的熱力學參數(shù)與作用力類型的確定

根據(jù)Van’t Hoff熱力學方程式[8]在298，303和308 K下求得熱力學參數(shù)結果為焓變ΔH=-34.14 kJ·mol-1，熵變ΔS=-32.55 J·(mol·K)-1，吉布斯自由能ΔG=-43.84 kJ·mol-1(298 K)，-43.88 kJ·mol-1(303 K)，-44.17 kJ·mol-1(308 K)。

根據(jù)Ross[9]等理論可知，ΔH<0，ΔS<0，可知MC與BSA之間在結合過程中，氫鍵和范德華力為主要作用力； 且ΔG<0，說明該反應自發(fā)進行。

2.4 MC與BSA之間的結合距離

如圖2所示，MC的紫外吸收光譜和BSA的熒光發(fā)射光譜之間存在一定程度的重疊，根據(jù)F?rster’s非輻射能量轉(zhuǎn)移理論公式[10]

(3)

(4)

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

(5)

圖2 BSA的熒光發(fā)射光譜(a)與MC的紫外吸收光譜(b)的重疊圖

Fig.2 The overlapping spectra of BSA fluorescence emission spectra (a) and UV absorption spectra (b) of MC

cBSA=6.0×10-7mol·L-1；

cMC=6.0×10-7mol·L-1；T=298 K； pH 7.40

計算得到MC與BSA的結合距離r，式(3)—式(5)中J為供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜兩者的重疊積分，F(xiàn)(λ)為BSA在波長為λ處的熒光強度，ε(λ)為MC在波長為λ處的摩爾吸光系數(shù)，Δλ為激發(fā)波長與發(fā)射波長的差值;E為能量轉(zhuǎn)移效率，F(xiàn)0為BSA溶液不加猝滅劑的熒光強度，F(xiàn)為加入猝滅劑后BSA的熒光強度，R0為臨界能量轉(zhuǎn)移距離，即能量轉(zhuǎn)移效率為50%的距離，r為給體受體間的距離；K2為偶極空間的取向因子，取給體與供體各向隨機分布平均值2/3，N為介質(zhì)折射指數(shù)，一般水和有機物折射指數(shù)的平均值1.336，Φ為供體的熒光量子產(chǎn)率，一般蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.118。

圖2表明，波長在300～450 nm范圍內(nèi)計算濃度比為1∶1時BSA的熒光光譜和MC的紫外吸收光譜的重疊積分J，J=1.942×10-19cm3·L·mol-1，求得臨界距離R0=0.112 3 nm，能量轉(zhuǎn)移效率E=4.1%，結合距離r=1.873 nm。根據(jù)F?rster’s非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，結合距離r<7 nm，說明BSA與MC之間能發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。

2.5 MC對BSA二級結構的影響

2.5.1 MC與BSA作用的紫外光譜分析

紫外光譜法操作方便、高靈敏度、得到結果快，分析藥物-蛋白體系的相互作用類型時，可依據(jù)二者的特征吸收峰的吸光度變化及位移，進一步推測藥物-蛋白的猝滅類型及蛋白周圍微環(huán)境變化信息。在298 K溫度下，測量在BSA中加入MC反應前后的紫外吸收光譜如圖3所示。

圖3 298 K溫度下MC與BSA的紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet Spectra of MC and BSA at 298 K

cBSA=2.0×10-5mol·L-1；cMC(1—10)： (0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1

圖3為298 K溫度下MC與BSA紫外光譜，隨著MC濃度的增加，BSA的最大吸收峰對應的吸光度明顯增大，最大吸收峰從278 nm處紅移至280 nm處，紅移的原因是嵌入藥物和蛋白質(zhì)的堿基對π電子結合，使能量降低，導致π→π*躍遷能量降低[11]，說明包圍在BSA內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水性增加，MC使BSA的二級結構發(fā)生了改變，由于靜態(tài)猝滅的吸收光譜會因為基態(tài)分子的改變而發(fā)生改變，進一步證明兩者作用為靜態(tài)猝滅。

2.5.2 MC與BSA作用的同步熒光光譜分析

同步熒光光譜法相比熒光光譜法進一步提升靈敏度和增加選擇性，具有簡化光譜、減弱散射光、窄化光譜等優(yōu)點。由圖4可以看出，當BSA濃度固定為5.0×10-7mol·L-1，逐漸增加MC的濃度使兩氨基酸的同步熒光光譜的熒光發(fā)射峰均出現(xiàn)猝滅，圖4(a)Δλ=15 nm時，峰形基本保持不變，圖4(b)Δλ=60 nm熒光峰由280 nm藍移到278 nm，說明MC可促進BSA中色氨酸(Trp)殘基所處的微環(huán)境極性減小，疏水性增加，親水性降低，引起B(yǎng)SA構象發(fā)生改變。對比圖5(a)與(b)，色氨酸(Trp)殘基對BSA熒光猝滅的貢獻要高于酪氨酸(Tyr)殘基，因此MC主要結合在BSA中的色氨酸(Trp)殘基上。

圖4 MC與BSA相互作用的同步熒光光譜圖Fig.4 Synchronous fluorescence spectra ofMC and BSA interactions(a)： Δλ=15 nm，(b)： Δλ=60 nm

cBSA=5.0×10-7mol·L-1；cMC(1—10)： (0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1；T=298 K； pH 7.40

2.5.3 MC與BSA三維熒光光譜分析

三維熒光的光譜數(shù)據(jù)相比二維熒光光譜，具有更多的坐標點，顯示的信息更精準，選擇性更高。BSA加入MC前后的三維熒光光譜圖見圖5，三維熒光參數(shù)見表2，由圖5的三維熒光光譜中可以看到兩種峰，一種是“山脊”狀的有序瑞利散射峰，如峰a，峰b(λex=λem)，加入MC后，BSA的熒光強度明顯降低，說明MC與BSA發(fā)生相互作用。另一種是類似“駝峰”的典型熒光峰，如峰1，峰2(2λex=λem)。其中峰1的光譜特性主要表現(xiàn)為Trp和Tyr殘基，峰2主要涉及到熒光光譜行為多肽骨架結構，其強度為與蛋白質(zhì)二級結構相關[12]。從表2中可以看出峰1的最大發(fā)射波長藍移4 nm，這說明MC的加入引起B(yǎng)SA的Trp和Tyr殘基周圍微環(huán)境的變化，使極性減小，疏水性增加； 峰2的熒光強度降低，且最大發(fā)射波長藍移3 nm，說明MC與BSA發(fā)生相互作用并誘導BSA的微環(huán)境和構象均發(fā)生變化。

圖5 BSA與MC相互作用前(a)后(b)的三維熒光光譜

Fig.5 The three-dimensional fluorescence spectra of BSA and MC solution before (a) and after (b) reaction

(a)：cBSA=1.0×10-7mol·L-1； (b)：cBSA=1.0×10-7mol·L-1，cMC=1.0×10-5mol·L-1；T=298 K； pH 7.40

表2 三維激發(fā)發(fā)射熒光光譜特征參數(shù)Table 2 Three-dimensional fluorescence spectra characteristic parameters

2.5.4 MC與BSA圓二色譜分析

圓二色譜法(CD)是一種通過在特定波長區(qū)間處掃描蛋白體系、藥物-蛋白體系，獲得CD譜圖以分析蛋白質(zhì)的二級結構變化情況的方法。由圖6看出，BSA分子的圓二色譜圖為雙負峰形，分別位于208和222 nm處，這是BSA的α-螺旋結構的特征峰，且隨著MC的加入，BSA的摩爾橢圓率有所升高。圓二色譜的測量結果用平均摩爾橢圓率(mean residue ellipticity，MRE)表示。α-螺旋結構的含量根據(jù)以下方程計算MRE，見式(6)和式(7)[13]

MRE=θobs/10(cNL)

(6)

α%=[(-[MRE]208-4 000)/(33 000-4 000)]×100%

(7)

式(6)和式(7)中，θ為CD測量的摩爾橢圓率；c為BSA的摩爾濃度，N為BSA中氨基酸殘基的個數(shù)，即583，L為所用樣品池的的光程為0.1 cm； 4 000為β-折疊和無規(guī)卷曲構象在201 nm的MRE； 33 000為α-螺旋結構在208 nm處的MRE。通過計算可知，逐步加入MC后，BSA中α-螺旋結構含量由31.75%依次變?yōu)?7.10%(cBSA∶cMC=1∶1)，54.39%(cBSA∶cMC=1∶5)，α-螺旋結構含量增加，表明了MC使得BSA分子的肽鏈收縮、疏水性增加、親水性降低，且以α-螺旋結構為主，說明MC改變了BSA的二級結構。

圖6 BSA與MC相互作用的圓服色譜圖Fig.6 The circular dichroism spectra of BSA interacting with MC

a：cBSA=1.0×10-5mol·L-1；b：cBSA=1.0×10-5mol·L-1，cMC=1.0×10-5mol·L-1；c：cBSA=1.0×10-5mol·L-1，cMC=5.0×10-5mol·L-1；T=298 K； pH 7.40

2.6 分子對接模擬

分子對接模擬技術是一種通過計算機模擬軟件將小分子結構與靶蛋白進行模擬對接，以結構的匹配程度來輸出藥物-蛋白體系相互作用的最優(yōu)結合形式及反應參數(shù)的方法。利用網(wǎng)頁程序Z-Dock進行結合位點的選擇和綁定點殘留的選擇，然后進行分子對接模擬見圖7。圖7(a)和(b)通過展示分子表面可以看出，MC結合位點在BSA的亞域區(qū)域ⅡA(位點site I，即華法林位點)的疏水腔內(nèi)。分析MC與BSA結合的微環(huán)境2D和3D示意圖7(c)，MC分子與BSA中的氨基酸殘基以范德華力結合作用的有： PHE508，LYS535，HIS534，PHE501，GLN579，VAL546，MET547，LEU528，PHE508，以氫鍵結合作用的有： LYS524，LEU531，產(chǎn)生超共軛效應的殘基有： ALA527，VAL575，LEU531，PHE508，可以看出各種作用力使MC與BSA緊密結合，范德華力和氫鍵為兩者的主要作用力，與熱力學判斷結果一致。

圖7 MC與BSA結合的分子對接模擬圖(a)： MC與BSA的分子對接模擬圖； (b)： MC與BSA飄帶狀模型對接圖； (c)： MC與BSA的微環(huán)境示意2D和3D圖Fig.7 Molecular docking simulation diagram of MC and BSA(a): The molecular docking simulation of MC and BSA; (b): Streamer shape molecular docking model diagram of MC and BSA;(c): Micro environment 2D, 3D diagram of MC and BSA

3 結 論

研究表明MC與BSA的猝滅機理為靜態(tài)猝滅，并且生成穩(wěn)定的配合物。根據(jù)熱力學參數(shù)的計算結果可知，ΔH<0，ΔS<0，MC與BSA之間的主要作用力類型為氫鍵和范德華力，ΔG<0，說明該反應是自發(fā)進行的。MC與BSA的結合距離r=1.873 nm，表明二者存在非輻射能量轉(zhuǎn)移。通過同步熒光光譜、三維熒光光譜、圓二色譜結果證明MC能夠改變BSA的二級結構和微環(huán)境。分子對接模擬表明MC結合位點在BSA的區(qū)域Ⅱ A(位點site I，即華法林位點)的疏水腔內(nèi)，引起了周圍殘基微環(huán)境疏水性的變化，研究結果為MC的臨床治療、藥效學以及藥代動力學上提供了重要的理論依據(jù)。