田文锠，陳毅挺，林曉森，沈開澤，林 靜，柯雪君

(閩江學(xué)院海洋學(xué)院，福建 福州 350108)

分子印跡技術(shù)是一種分離純化技術(shù)，針對選定的模板分子制備對其有特異性識別能力的聚合物，可從復(fù)雜的介質(zhì)中吸附分離目標(biāo)物[1-5]。該技術(shù)具有構(gòu)效可預(yù)定與選擇性識別等優(yōu)點(diǎn)[6-9]，已成為分析化學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的前沿技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于生物傳感[10-12]、藥物的檢測[13-14]、固相萃取[15-17]等諸多領(lǐng)域。研究適合蛋白質(zhì)等大分子的分子印跡材料可以對醫(yī)藥學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的開展提供一定的幫助[18-22]。但由于生物分子的特殊性質(zhì)，如大的分子尺寸、復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)、大量的功能基團(tuán)、水溶性等，使得對應(yīng)的印跡技術(shù)出現(xiàn)了諸如所形成的較大的印跡空穴容易塌陷、聚合效率不高等問題，而離子液體的引入可以有效地改善分子印跡膜的性質(zhì)[23-26]。

離子液體是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的、在室溫或室溫附近的溫度下呈液體狀態(tài)的鹽類[27-28]。離子液體具有液體溫度范圍較寬，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且易于改性等特點(diǎn)[29]。離子液體內(nèi)部分子之間的作用主要有陰陽離子的靜電引力、范德華力、氫鍵力等[30-31]，尤其是陰陽離子的靜電力對分子印跡聚合物的制備有著特殊的影響。離子液體相比傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑，具有極佳的溶解性，而相比于水相溶劑，則不易破壞模板分子和功能單體間的特異性相互作用[32-33]。因此，用離子液體取代常規(guī)溶劑制備分子印跡聚合物是有前景的。

牛血紅蛋白(bovine hemoglobin，BHb)是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧的特殊蛋白質(zhì)，并協(xié)助參與二氧化碳的運(yùn)載，調(diào)節(jié)血液的酸度，具有顯著的生理作用[34-35]。以納米材料為載體的分子印跡技術(shù)，吸附容量大，且利于目標(biāo)蛋白的分離與富集[36-39]。本論文以功能化石墨烯(Grapheneoxide，GO)為基質(zhì)，牛血紅蛋白為模板分子，離子液體和丙烯酰胺(Acrylamide， AAM)為復(fù)合功能單體，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N，N’-methylenebisacrylamide，NNMBA)為交聯(lián)劑進(jìn)行聚合，以制備對BHb具有特異識別的分子印跡材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血紅蛋白購自上海源葉生物科技有限公司；氧化石墨烯購自蘇州碳豐科技；碘化-1-乙烯基-3-甲基咪唑購自上海成捷化學(xué)有限公司；N, N’-亞甲基雙丙烯酰胺(NNMBA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、氯乙酸購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine，TEMED)購自上海譜振生物科技有限公司；所用試劑未注明的均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

F380熒光光譜儀(天津港東)，is5傅立葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛)，SU8010場發(fā)射掃描電鏡(日本日立)，THZ-82水浴恒溫振蕩器(易晨儀器制造有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 分子印跡聚合物的制備過程

制備過程示意圖如圖1所示。首先在200 mL氧化石墨烯超聲分散液(1 mg·mL-1，超聲10 min)加入10 g NaOH和10 g 氯乙酸，水浴超聲反應(yīng)3 h，用稀HCl中和后用超純水反復(fù)離心沖洗至中性，冷凍干燥，從而得到羧基化石墨烯[40]。向干燥燒瓶中加入600 mg羧基化石墨烯，60 mL二氯亞砜，8 d DMF，70 ℃回流24 h后，將剩余的二氯亞砜用NaOH溶液吸收。將產(chǎn)物蒸干后，加入6 g AAM，50 mL DMF，超聲10 min，于45 ℃回流24 h后，用超純水洗至中性，真空干燥2 h，得到丙烯酰胺化石墨烯[41]。

在錐形瓶中加入5 mg BHb，25 mg碘化1-乙烯基-3-甲基咪唑和7.5 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 6.8)，攪拌2 h。接著加入37.5 mg NNMBA并攪拌30 min，隨后將10 mg 丙烯酰胺化石墨烯和200 mg 丙烯酰胺加入上述溶液當(dāng)中，反應(yīng)20 min后依次加入7.5 mg 過硫酸鉀和25 μL TEMED，通氮除氧后密封，水浴震蕩反應(yīng)48 h。將產(chǎn)物過篩加入洗脫液(10%(體積分?jǐn)?shù))乙酸+0.1 g·mL-1十二烷基硫酸鈉)進(jìn)行洗脫(每次加洗脫液后都要超聲2 min)，再用去離子水洗脫至無蛋白質(zhì)殘留，冷凍干燥，得到分子印跡聚合物(MIP)。

制備空白印跡聚合物(NIP)無需加入BHb作為模板分子，其余步驟同MIP。

圖1 印跡材料合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of imprinted material synthesis

1.3 吸附性能評價(jià)

稱取3 mg的MIP，加入5 mL濃度為0.25 mg·mL-1的BHb溶液，靜置吸附24 h后測其上清液牛血紅蛋白濃度，按照以下公式[26]計(jì)算BHb的吸附容量：

Q= (Ci-Cf)V/m

式中：Q為單位質(zhì)量分子印跡材料吸附的蛋白量(mg·g-1)；Ci為蛋白原始濃度(mg·mL-1)；Cf為吸附后剩余蛋白濃度(mg·mL-1)；V為混合液的體積(mL)；m為所用印跡材料的質(zhì)量(g)。

MIP與NIP的專屬性可以通過印跡因子(IF)進(jìn)行評價(jià)[42]，其計(jì)算公式為：

IF=△QMIP/△QNIP

式中：△QMIP和△QNIP分別為MIP與NIP的吸附容量。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物合成條件優(yōu)化

2.1.1 牛血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 牛血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Bovine hemoglobin standard curve

配制一系列不同濃度的BHb溶液，測量各溶液在406 nm處的吸光度[43]，每份溶液平行測量3次后取平均值，繪制得到BHb的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

如圖2所示，吸光度與BHb的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所得曲線方程為A=0.005 7×C(mg·L-1)-0.009 6，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。

2.1.2 離子液體用量的選擇

向10 mL容量瓶中分別加入5 mg離子液體，15 mg離子液體，25 mg離子液體，50 mg離子液體，75 mg離子液體，5 mg Bhb和7.5 mL磷酸緩沖溶液(pH=6.8)，按照1.2中步驟合成MIP與NIP，并測得各自的吸附容量，如圖3所示。

圖3 離子液體用量對吸附容量的影響Fig.3 Effect of ionic liquid dosage on adsorption capacity

由圖3可見，隨著離子液體添加量的增多，雖然MIP和NIP吸附容量都有所增加，在功能單體的用量為25～75 mg，合成的MIP有比較高的吸附容量，但當(dāng)離子液體用量為50、75 mg時(shí)，NIP的吸附容量也比較大，因此選擇分子印跡材料制備中離子液體的用量為25 mg。

2.1.3 交聯(lián)劑用量的選擇

圖4 交聯(lián)劑用量對吸附容量的影響Fig.4 Effect of crosslinking agent dosage on adsorption capacity

按照1.2中步驟合成MIP與NIP，分別加入12.5、25、37.5、50、62.5 mg NNMBA，以考察交聯(lián)劑對分子印跡材料吸附能力的影響，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，當(dāng)交聯(lián)劑NNMBA用量為25 mg與37.5 mg時(shí)，MIP的吸附性能最強(qiáng)，此后隨著交聯(lián)劑用量的增加，MIP的吸附容量明顯下降，說明過多的交聯(lián)劑會造成分子印跡材料內(nèi)針對于模板分子的空穴減少，不利于分子印跡材料對BHb的識別。而NIP在NNMBA用量為37.5～62.5 mg時(shí)均較小，因此，確定交聯(lián)劑NNMBA的用量為37.5 mg。

2.2 分子印跡聚合物性能表征

2.2.1 掃描電鏡圖

制備出來的MIP和NIP進(jìn)行掃描電鏡表征，得到的結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見，MIP的表面形態(tài)粗糙、有空隙，而NIP表面形態(tài)就平整得多，其造成MIP表面凹凸不平的原因是它有模板分子參與形成聚合物，之后表面蛋白質(zhì)被洗脫后留下空穴，從側(cè)面說明模板分子得到了洗脫。

圖5 MIP(左)和NIP(右)的電鏡圖Fig.5 SEM images of MIP(left)and NIP(right)

圖6 紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram

2.2.2 紅外光譜

分別掃描離子液體、未加入離子液體的MIP與加入離子液體的MIP的紅外光譜，結(jié)果如圖6所示。

從圖6可以看出有加離子液體的MIP上，3 452.438 cm-1為- N- H的振動吸收峰；2 934.644 cm-1為C=C- H的振動吸收峰；1 681.141 cm- 1為- C=O的振動吸收峰；1 653.660 cm-1為C=C的振動吸收峰；2 967.910 cm- 1為- CH2的振動吸收峰；1 240.486 cm-1為- C- N的振動吸收峰[44]，上述這些特征吸收峰都是交聯(lián)劑所產(chǎn)生的。2 993.945 cm-1為咪唑陽離子上 C-H的吸收峰；1 580.379 cm-1為咪唑環(huán)骨架所產(chǎn)生的振動吸收峰源，1 457.439 cm-1為甲基 C-H 的振動吸收峰。1 158.044 cm-1為咪唑環(huán)的吸收峰[45]，這些峰為離子液體的特征吸收峰。這說明離子液體已成功連接到聚合物上，而沒有隨著洗脫過程流失。

2.3 吸附性能評價(jià)

2.3.1 緩沖液pH值的影響

圖7 緩沖液pH值的優(yōu)化圖Fig.7 Optimization diagram of buffer pH value

吸附過程中環(huán)境的酸度對于吸附量會有明顯的影響，控制溶液pH分別為3.0、4.0、5.8、6.8、8.8、10.0，按照1.3中的步驟得到各pH值下BHb的吸附容量(圖7)。

從圖7可以看出，添加的緩沖液PBS的pH值不相同，對聚合物吸附Bhb的量和吸附特異性會造成影響，當(dāng)pH為5.8時(shí)，NIP的吸附量較小而MIP的吸附量最大，因此選擇緩沖液的pH為5.8。

2.3.2 等溫吸附實(shí)驗(yàn)

圖8 等溫吸附曲線Fig.8 Isothermal adsorption curve

吸附等溫線可有效評價(jià)MIPs對模板蛋白的飽和吸附容量。將MIPs和NIPs加入不同濃度的BHb蛋白溶液中吸附后測量上印跡材料對蛋白的吸附量，所得結(jié)果如圖8所示。

圖9 吸附與脫附曲線Fig.9 Adsorption and desorption curves

從圖8中可以看出，在50～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，MIP的吸附容量隨BHb濃度的增加而增大，同時(shí)NIP與MIP的吸附容量差距顯著增大。這是由于NIP本身具有一定的非特異性吸附容量，在溶液中較快達(dá)到吸附平衡。當(dāng)BHb濃度較低時(shí)，MIP與NIP的吸附容量差距無法拉開，而當(dāng)BHb濃度較高時(shí)，由于MIP具有對應(yīng)BHb的三維空穴和結(jié)合位點(diǎn)，MIP對BHb的選擇性逐漸顯現(xiàn)。

2.3.3 吸附與洗脫

模板分子的吸附和洗脫是印跡材料的關(guān)鍵因素，考察了不同吸附和洗脫時(shí)間下印跡材料對BHb的吸附量，結(jié)果如圖9所示。

MIPs對BHb的印跡形式可能有表面印跡或埋在表面聚合物里面的印跡[46]。由圖9可見，當(dāng)吸附時(shí)間為20 min之前，MIP吸附動力學(xué)曲線的斜率較大，此時(shí)印跡形式主要為表面印跡，傳質(zhì)阻力較低。吸附時(shí)間達(dá)到20 min后，MIP的吸附量變化減小，此時(shí)印跡形式主要為埋在表面聚合物里面的印跡，BHb進(jìn)入MIP的傳質(zhì)阻力增大。40 min后MIP吸附量趨于平穩(wěn)狀態(tài)。而NIP的吸附速率明顯低于MIP，說明NIPs雖對BHb具備一定的吸附能力，但吸附容量低于MIP。吸附40 min，印跡因子(IF)為3.03，說明MIPs對模板分子的吸附量主要是由于印跡聚合物形成許多三維空穴和結(jié)合位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)BHb的特異性識別。同時(shí)，對吸附達(dá)到飽和后的MIP進(jìn)行洗脫，當(dāng)洗脫時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，印跡材料中的BHb幾乎完全被洗脫。

2.3.4 競爭性與重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)

圖10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Fig.10 Repeated experiments

為考察印跡材料對模板蛋白和干擾蛋白的選擇性識別，將MIP置于BHb、細(xì)胞色素C(Cyt C)、卵清白蛋白(OVA)與牛血清白蛋白(BSA)中，各自的吸附容量分別為305、65、139、73 mg·g-1，說明制備出的MIP對Bhb有較好的選擇性識別。

利用MIP對BHb進(jìn)行了5次吸附-解吸-再吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖10所示。5次吸附容量無明顯變化，其中第3、5次吸附容量分別為首次的91.35 %與86.56 %，說明合成的印跡聚合物的再生性能良好。吸附容量略有減小可能是由于洗脫液不能將血紅蛋白洗脫充分，造成再吸附的時(shí)候，結(jié)合血紅蛋白的印跡位點(diǎn)減少。

3 結(jié)論

以丙烯酰胺化石墨烯為基質(zhì)，BHb為模板分子，離子液體和丙烯酰胺為功能單體，N-N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，所制備的分子印跡聚合物對BHb具有特異性吸附，并且重復(fù)利用性較高。