譚娟娟，賴嘉嘉，林心樂，邱小真，許文宏，李艷霞

(閩江學院海洋學院，福建 福州 350108)

分子印跡技術是一種合成具有特異性吸附的高分子材料技術。印跡技術的基本原理是，利用目標分子充當模板分子(印跡分子)和單體在交聯劑和引發(fā)劑的作用下合成印跡聚合物。利用物理或化學反應除去模板分子，印跡材料就形成與模板分子尺寸、結構相應的印跡腔穴，這樣的印跡材料對目標分子具有特異性識別功能。目前，分子印跡技術已在分離純化、生物傳感、手性識別中得到廣泛應用[1-2]。早期的蛋白印跡材料的制備方法較為簡單，由于蛋白質分子體積大而且純度不高，因此，印跡分子去除困難，專一性識別能力低，容易發(fā)生非特異性吸附?，F在小分子印跡技術已發(fā)展得比較成熟，而對大分子蛋白質印跡的進展卻不明顯。蛋白質印跡方法可分為：包埋法、表面印跡法、抗原決定基法。與小分子印跡相比蛋白質分子印跡存在蛋白質體積大、結構復雜、構象易變和識別位點的精準性不夠等缺陷，生物大分子印跡識別機理尚無完整的系統理論，大分子復雜的空間結構和印跡材料作用的多樣性都是當前印跡機理研究的主要問題[3-5]。

本文以KH570修飾的二氧化硅納米為載體粒子，以丙烯酰胺、丙烯酸作為功能單體，甲叉雙丙烯酰胺作為交聯劑，Con A作為模板分子，模板分子與修飾基團之間的相互作用能將模板分子限制在納米粒表面, 在單體溶液發(fā)生聚合的同時產生印跡位點，TEMED催化引發(fā)劑APS產生大量自由基加速聚丙烯酰胺聚合，通過離心除去未交聯的功能單體以及洗脫模板分子得到印跡聚合物(MIPs)。先后對印跡材料聚合條件、測試條件等進行了優(yōu)化，探究材料對不同蛋白的親和性以及在實際應用的可能性，以期實現對Con A高選擇性的分離富集。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

納米二氧化硅(KH570處理，粒徑20 nm，純度99%(質量分數)，購自于南京先豐納米科技有限公司)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酸、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、冰乙酸(HAc)、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化鈉(NaCl)，以上試劑均為分析純。Con A(刀豆球蛋白)、OVA(卵清白蛋白)、Hb(牛血紅蛋白)、BSA(牛卵清白蛋白)、HRP(辣根過氧化物酶)、GOD(葡萄糖氧化酶)、Lyz(溶菌酶)以上蛋白純度≥95%，胎牛血清(優(yōu)級純)，購自福州鼎國生物科技有限公司)，所用水均為超純水。

吸附容量采用UV-2550紫外可見光吸收光譜儀(日本島津公司)測定蛋白吸附前后最大吸光度的變化；采用FTEM 透射電子顯微鏡(FEI Tecnai G2 F20)；Nicoler iS50 傅立葉轉換紅外光譜儀(美國賽默飛尼高力)；TG-DSC分析儀(德國耐馳)用于印跡材料的表征。

1.2 Con A印跡材料的制備

稱取 15 mg Con A、30 mg 納米SiO2加入適量的超純水用超聲波混勻，再加入 15 mg 丙烯酰胺、5 mg 甲叉雙丙烯酰胺、2 μL 丙烯酸，用超純水分散至5 mL，振蕩預組裝1 h 后，再加入10 μL，10% APS、2 μL TEMED在室溫下振蕩，聚合反應 4 h 后，得到含有Con A印跡聚合材料。離心洗去未反應的單體、模板蛋白等，超純水清洗3遍，10%的乙酸溶液浸泡1 h，去除印跡蛋白，再用超純水清洗殘留乙酸，反復3次，然后將材料于烘箱中低溫40 ℃烘干，干燥器中保存，備用。由此得到了Con A印跡材料(MIPs)。作為對照實驗，非印跡材料采用相同的合成方法，但要省略加入Con A模板蛋白這一步驟，所制備的材料記為NIPs。

2 結果與討論

2.1 印跡材料的制備

2.1.1 印跡材料的制備路線設計

通過TEMED催化引發(fā)劑APS產生大量自由基，將丙烯酰胺和丙烯酸作為功能單體和輔助單體，甲叉雙丙烯酰胺作為交聯劑，與模板蛋白Con A共聚合于 SiO2表面，經洗脫，得到Con A印跡聚合物材料可特異性識別目標蛋白。本設計方案的特點在于,首先，SiO2價格低廉，其表面富含的不飽和鍵，利于表面印跡層的形成；其次，兩種功能單體，丙烯酰胺富含的氨基和丙烯酸富含羧基，用于增加識別位點，利于目標蛋白的識別。Con A分子印跡合成路線，如圖1所示。

圖1 印跡聚合物合成路線圖Fig.1 Synthesis route of MIPs

合成Con A印跡材料后，需要對該材料的一些功能，選擇性，吸附容量等做一些測試：蛋白質的吸附量根據以下公式計算[19]

Q= (Ci-Cf)V/m

(1)

式中：Q為單位質量材料吸附的蛋白量(mg·g-1)；Ci為蛋白質的原始濃度(mg·mL-1)；Cf為吸附后的蛋白質濃度(mg·mL-1)；V為混合溶液的體積(mL)；m為印跡材料的質量(g)。

2.1.2 TEM表征分析

利用TEM對KH570-SiO2、和MIPs的形貌進行了表征。圖2(a)和(b)中可以看出MIPs與SiO2的顆粒呈現球形，粒徑均一，通過測量得到SiO2的平均粒徑約18 nm，MIPs粒子平均粒徑約23 nm。與圖2(a)中的二氧化硅相比，MIPs的顆粒表面較為粗糙且載體顆粒的界面被一層透明物質包裹，說明納米二氧化硅周圍包裹一層顏色較淺的膜，成功地形成了印跡層。

圖2 TEM表征圖Fig.2 TEM images of SiO2 (a) and MIP (b)

2.1.3 傅立葉轉換紅外光譜分析(FTIR)

圖3 印跡材料的FTIR圖Fig.3 FTIR spectra of SiO2 and MIPs SiO2(a)；MIPs(b)

由圖3可知，曲線a中3 443 cm-1寬峰為二氧化硅分子間氫鍵-OH的伸縮振動峰，2 929 cm-1，1 627 cm-1處出現=CH2和C=O(-COO)的伸縮振動吸收峰，1 100 cm-1處的強寬峰為Si-O-Si的反對稱伸縮振動峰，800 cm-1為Si-O鍵的對稱伸縮振動峰。曲線b中，在2 927 cm-1和2 778 cm-1出現的峰是-CH2-的伸縮振動峰，1 655 cm-1處出現的是C=O(-COOH)的伸縮振動峰，1 617 cm-1和1 358 cm-1的峰是由C=O(-CONH2)的伸縮振動和-CH2-的變形振動引起的，這些現象表明印跡材料的合成設計路線是合理的。

圖4 材料的熱重分析曲線Fig.4 Thermo gravimetric analysis curves of different materials

2.1.4 熱重分析

采用熱重表征Con A印跡聚合物的組成，從40 ℃升溫至800 ℃，氮氣保護，升溫速率約10 ℃/min，通過對中間產物的熱重分析，可推測分析出納米材料表面聚合有機層的組成。如圖4所示，從上到下分別為MIPs (a)，NIPs(b)，KH570-SiO2(c)，Con A+MIPs(d)的失重曲線。失重過程可以分為3個階段：在溫度100 ℃左右，失重的成分是納米材料吸附的水分；當溫度從100 ℃升高到300 ℃時，為失重的主要階段，重量出現的持續(xù)下降，MIPs，NIPs，KH570-SiO2，Con A + MIPs四者整體失重趨勢接近，這主要是由于SiO2表面功能化配體和有機聚合物層的逐步分解揮發(fā)失重。隨著溫度的升高，Con A+ MIPs曲線失重量大且呈現大幅度下降較難趨于穩(wěn)定，200～400 ℃出現較快的失重，代表印跡蛋白的受熱分解，證明大量Con A被MIPs吸附。接著曲線持續(xù)下降，仍然為聚合物層的逐步熱分解及SiO2的氧分解。

2.1.5 聚合時間優(yōu)化

圖5 聚合時間對MIPs吸附量的影響Fig.5 Effect of polymerization time on MIPs adsorption capacities

經過預組裝的納米二氧化硅在APS與TEMED的催化下，在0.5、1、2、4、12 h以上不同的時間條件下加速聚丙烯酰胺在氧化硅表面聚合的五組樣品。進行模板蛋白(Con A)的吸附后，Con A吸附量如圖5所示，聚合時間為 0.5，1，2 h得到的印跡材料，由于聚合時間短，印跡層未完全形成，模板蛋白結合點的印跡腔穴深淺不均，數量少，蛋白與腔穴的結合力小且容易脫離，因此蛋白吸附量低。聚合反應4 h后，二氧化硅上的印跡層已包裹完整，模板蛋白易洗脫，形成的印跡腔穴數量多，此時對模板蛋白的響應強，吸附量最大。聚合反應12 h以上時，模板蛋白大部分被包埋在聚合層深處，由于空間位阻效應，不易將聚合層深處模板蛋白洗脫去除，印跡層深處的結合位點少，因此對模板蛋白的吸附量低。

圖6 不同洗脫液對MIPs吸附量Fig.6 Adsorption capacities of MIPs with different eluents

2.1.6 洗脫液的選擇

洗脫液的選擇影響到MIPs對模板蛋白的響應值，因此模板分子的洗脫是分子印跡制備中的關鍵一步。在模板蛋白洗脫過程中，往往難以徹底洗去模板分子，尤其對于空間結構復雜的蛋白分子，這將影響到印跡材料的吸附性能。為盡可能洗去模板蛋白，本文采用10% HAc，10% SDS，1 mol·L-1NaCl，5% HAc + 5% SDS等洗脫液對模板蛋白進行洗脫，對蛋白吸附后的吸附量變化作圖，比較不同洗脫液的洗脫效果。圖6可見，使用5% HAc + 5% SDS混合洗液進行洗脫的印跡材料對蛋白的吸附量明顯高于其他的洗脫液，說明用5% HAc + 5% SDS洗液得到的特異性空穴多，因此對蛋白的吸附量大。

2.1.7 洗脫時間的優(yōu)化

以5% HAc + 5% SDS作為洗脫液進行洗脫，其洗脫效果如圖7所示，隨著洗脫時間的增加，蛋白的吸附量逐漸增加，0～20 min洗脫時間較短，模板蛋白洗脫量少，產生的印跡空穴數量較少。洗脫至20～60 min時MIPs的吸附容量變化較小，40 min后逐漸趨于平穩(wěn)，表明模板蛋白已基本洗脫完全，形成大量印跡空穴，達到最佳吸附容量，因此選擇40 min作為最佳洗脫時間。

圖7 不同洗脫時間下MIPs的吸附量Fig.7 Adsorption capacities of MIPs under different elution time

圖8 Con A在MIPs和NIPs上的吸附等溫線Fig.8 Adsorption isotherms of Con A on MIPs and NIPs

2.2 印跡材料的性能

2.2.1 吸附等溫曲線

考察MIPs和NIPs的吸附容量可以判斷聚合材料的印跡效果。設定的濃度范圍為0～1.0 mg·mL-1的Con A溶液，進行吸附 1 h，隨著Con A濃度的增加，觀察吸附量曲線的變化趨勢。圖8可看出，MIPs和NIPs的吸附量Q隨著Con A濃度的增加而逐步提高，當初始濃度增加到0.6 mg·mL-1時吸附量變化趨于平穩(wěn)，這由于Con A分子與印跡層的空穴結合達到飽和吸附，MIPs和NIPs的飽和吸附量分別為166.76和99.17 mg·g-1，兩者表現出顯著差異，證明MIPs的印跡層形成的印跡空穴可有效吸附目標蛋白。Con A分子印跡材料對蛋白濃度在0～1.0 mg·mL-1范圍內表現出較好的動態(tài)響應，而非印跡材料缺少印跡腔，對蛋白的吸附是為物理吸附。這一結果表明MIPs在模板蛋白參與的聚合過程中產生了與Con A分子結構與官能團相匹配的印跡腔穴。

圖9 MIPs對Con A的吸附動力學影響Fig.9 Adsorption kinetics of MIPs to Con A

2.2.2 吸附動力學

吸附動力學是考察MIPs對模板蛋白(Con A)進行特異性吸附所需要的平衡時間。如圖9顯示了MIPs吸附量隨時間變化的趨勢圖，圖中前10 min目標蛋白的吸附量急劇增加，伴隨著吸附時間的延長，Con A特異性吸附速率開始降低。10 min前蛋白快速被吸附，10 min后蛋白吸附緩慢的原因可能是前期蛋白主要與印跡層表面的位點結合，后期由于印跡層表面的結合點被飽和后，印跡聚合物內部與蛋白結合時間延長，也就是后期蛋白吸附速率較為緩慢。當吸附時間到達20 min后分子印跡的吸附量不再上升，說明MIPs對Con A特異性吸附達到飽和平衡，表現出快速吸附能力。

2.2.3 不同材料對Con A 的吸附能力

對KH570-SiO2、MIPs、NIPs及Con A-MIPs進行模板蛋白吸附量測試，如圖10所示，MIPs因為具有與刀豆蛋白結構大小相同的印跡腔穴，所以對蛋白的吸附量是最高的，而NIPs的吸附量僅次于MIPs是因其非特異性的物理吸附蛋白，作為固載材料的KH570-SiO2本身是一種介孔材料，載體分子間存在空隙，因此對蛋白存在一定的非特異性物理吸附，含有刀豆蛋白的MIPs對Con A存在最弱的吸附能力，由于印跡分子與印跡腔穴處于吸附-解吸的動態(tài)過程，與MIPs相比，而被飽和吸附的印跡空穴對Con A的吸附能力顯著減弱。結果顯示，MIPs對Con A有良好的吸附能力。

圖10 不同材料對Con A的吸附效果Fig.10 Adsorption effect of different materials to Con A

2.2.4 選擇性吸附

圖11 MIPs和NIPs對不同蛋白的吸附容量Fig.11 Adsorption capacity of MIPs and NIPs to different proteins

為了考察MIPs對模板蛋白的特異選擇性能力，除模板蛋白Con A以外，另選蛋白質OVA、 BSA、Hb、HRP、GOD、Lyz 檢驗MIPs和NIPs的選擇吸附能力，如圖11，結果表明實驗所制備的分子印跡聚合物對上述非模板蛋白特異性吸附不明顯，因為分子量大的蛋白分子在MIPs吸附時空間位阻效應大，對模板蛋白Con A的特異性吸附量明顯高于其他蛋白。而NIPs對非模板蛋白的吸附主要以非特異性吸附為主。

印跡因子IF和選擇系數k可以看出MIPs對不同蛋白間識別能力的大小[20-21]，可作為MIPs的特異選擇性評價的指標之一。IF和k值越大，MIPs的選擇性能越好，結合效果越強。

對IF的定義是MIPs與NIPs的吸附容量之比，即:

IF=QMIPs/QNIPs

(2)

分配系數Kd選擇性系數k分別為

Kd=[(Ci-Cf)/Ci]V/m

(3)

K=KdMIPs/Kd NIPs

(4)

根據公式(2)、(3)和(4)計算,結果如表1所示，MIPs對ConA、BSA、OVA、HRP、GOD、Hb和Lyz的IF分別為1.67，0.97，0.95，0.67，0.52，0.36和1.03，除Con A蛋白外，其余非模板蛋白的印跡因子均接近1，則表明本文制備的MIPs含有與Con A相對應的印跡結合腔，能夠對模板蛋白Con A產生有效的特異結合，MIPs和NIPs對非模板蛋白的吸附量沒有明顯的差異，是由于MIPs、NIPs中沒有與非模板蛋白結構相應的結合腔穴，不能對蛋白產生高效的選擇，只能依靠材料本身的非特異性的物理吸附來與蛋白結合?？梢姡琈IPs具有良好的特異識別能力。MIPs對BSA、OVA、HRP、GOD、Hb和Lyz的選擇性系數分別為1.73，3.10，4.91，12.80，15.98和14.44，該數據說明MIPs對非模板蛋白具有良好的選擇性能，尤其是對GOD，Hb，Lyz蛋白有非常高的選擇性。

表1 MIPs對不同蛋白的選擇性參數Tab.1 Selectivity parameters of different proteins on MIPs

2.2.5 實際樣品分析

圖12 MIPs和NIPs在FBS和尿液中對Con A 的吸附效果Fig.12 Adsorption effects of Con A on MIPs and NIPs in FBS and urine

為進一步考察所制備的MIPs實際應用價值和分離效果，選擇空白胎牛血清(FBS)和人體尿液(Urine)作為生物樣品，進行添加回收實驗。牛血清中主要包含大量的BSA和少量BHb蛋白，而尿液中主要包含尿酸、尿素、水、無機鹽和葡萄糖等生物小分子。將稀釋20倍的FBS、稀釋5倍的尿液分別添加一定量Con A，使其終濃度均為0.6 mg·mL-1，通過吸附實驗，測MIPs和NIPs 對這些樣品的吸附量(Q)，結果如圖12所示?？梢钥闯?，MIPs和NIPs對FBS和尿液表現出較弱的非特異性吸附，當添加Con A 后，吸附量顯著增加，扣除背景非特異性吸附，MIPs在FBS溶液中，對Con A回收率為76.5%，在尿液溶液中，對Con A回收率為82.4%，這一結果證明高濃度干擾蛋白和生物小分子在Con A吸附過程中干擾較小，可望用于生物樣本中Con A的分離與富集。

3 結論

本文以丙烯酰胺、丙烯酸作為功能單體，甲叉雙丙烯酰胺作為交聯劑，以Con A作為模板分子，KH570處理的SiO2納米粒子作為載體制備Con A 印跡材料。SiO2表面富含的不飽和鍵，利于表面印跡層的形成，引入的羧基用于增加識別位點，利于目標蛋白的識別。所制備的材料具有較高的吸附容量和選擇性，表現出快速的吸附解吸過程。該材料制備簡單，有望作為復雜樣品中富集分離目標蛋白的材料, 同時也為其他的蛋白印跡合成提供了思路。