施棟梁，胡曉梅，鄭宇輝，邱小文，黃建平，楊映紅

骨髓組織活檢是明確骨髓病變最主要的方法之一，但由于骨髓組織中含有大量的磷酸鈣和碳酸鈣，在常規(guī)制片中易致切片破碎、刀痕嚴(yán)重等問(wèn)題，因此對(duì)骨髓組織進(jìn)行充分的脫鈣也顯得格外重要[1-2]。目前在臨床工作中，我們常使用的脫鈣液有酸類(lèi)脫鈣液、電解質(zhì)脫鈣液、螯合劑脫鈣液、離子交換樹(shù)脂脫鈣液等[2-3]。這些脫鈣液作用機(jī)制不同，效果各有千秋[4]。在實(shí)際臨床工作中我們對(duì)脫鈣液選擇的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是效果強(qiáng)、時(shí)間短、對(duì)組織細(xì)胞形態(tài)以及對(duì)抗原影響小等[5]。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)多年的工作經(jīng)驗(yàn)，采用2%鹽酸脫鈣液應(yīng)用于骨髓組織活檢中，并取得了良好的效果，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院病理科2018年1月～2019年3月使用2%鹽酸脫鈣液脫鈣的骨髓組織活檢標(biāo)本500例。標(biāo)本類(lèi)型為骨髓穿刺活檢組織，標(biāo)本直徑0.2 cm，長(zhǎng)度>1.0 cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑全自動(dòng)染色儀HE600購(gòu)自美國(guó)Ventana公司；TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda購(gòu)自福州邁新公司；PAX5購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；二抗、檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)、DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自福州邁新公司；濃鹽酸溶液(鹽酸含量36%～38%)購(gòu)自上海試一化學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.12%鹽酸脫鈣液配制 取5.4 mL濃鹽酸(鹽酸濃度36%～38%)和94.6 mL蒸餾水，制成濃度為2%鹽酸脫鈣液。

1.3.2脫鈣方法(后脫鈣法) 新鮮的骨髓穿刺組織經(jīng)取材后及時(shí)用10%中性福爾馬林固定4～6 h；在全自動(dòng)脫水機(jī)中脫水、浸蠟；包埋時(shí)將骨髓組織沿包埋框的對(duì)角線(xiàn)放置，待冷卻后制成蠟塊；蠟塊修整時(shí)充分暴露骨髓組織最大面，隨后將最大組織面浸泡于2%鹽酸脫鈣液中，使得鹽酸脫鈣液充分與骨髓組織表面接觸；每5～10 min用大頭針探測(cè)骨髓組織表面，當(dāng)大頭針能輕易刺入組織時(shí)提示脫鈣完成，若刺入時(shí)有阻力則需繼續(xù)脫鈣。脫鈣后將骨髓活檢組織置于冰盤(pán)上，待進(jìn)行常規(guī)切片。

1.3.3HE染色 常規(guī)組織切片后應(yīng)用Ventana HE600進(jìn)行骨髓HE染色。

1.3.4免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法染色，70 ℃烤片60 min，二甲苯脫蠟20 min至無(wú)水乙醇溶液，水洗，檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)高壓鍋修復(fù)2.5 min，3%過(guò)氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，分別滴加一抗，室溫孵育120 min，PBS沖洗，滴加增強(qiáng)劑孵育20 min，PBS沖洗后滴加二抗，孵育30 min，PBS沖洗，DAB室溫顯色3～5 min，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染，氨水返藍(lán)，脫水、透明、封固。

1.3.5抗體選擇及結(jié)果判定 選取在急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤診斷中常用的抗體。PAX5(MX017)、TdT(SEN28)是細(xì)胞核抗原，CD20(L26)、CD56(MX039)是細(xì)胞膜抗原，Kappa(多克隆)、Lambda(LAM03+HP6054)是細(xì)胞質(zhì)抗原。切片按照染色陽(yáng)性強(qiáng)度分別進(jìn)行評(píng)估，分為強(qiáng)陽(yáng)性()、中等陽(yáng)性()、弱陽(yáng)性(+)和陰性(-)。其中陰性和弱陽(yáng)性為低表達(dá)，中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 脫鈣時(shí)間及制片效果骨髓組織經(jīng)2%鹽酸脫鈣液處理后，平均脫鈣時(shí)間為(65±15) min，脫鈣時(shí)間較短。應(yīng)用該方法制片效果良好，制片時(shí)易切出完整的切片，且對(duì)刀片的損傷小(圖1)。

2.2 HE染色骨髓組織經(jīng)2%鹽酸脫鈣液處理后，HE染色顯示骨髓組織形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)層次分明，透明度好(圖2)。按照HE制片質(zhì)控評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，HE染色平均得分為91分(>90分為優(yōu)質(zhì)的玻片標(biāo)本)。

2.3 免疫組化染色PAX5、TdT陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，CD20、CD56陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，Kappa、Lambda定位于細(xì)胞質(zhì)。PAX5、TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda在組織中表達(dá)良好，陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，背景清晰(圖3)。

圖1 應(yīng)用2%鹽酸脫鈣液脫鈣后骨髓組織制片效果

圖2 骨髓組織HE染色，結(jié)構(gòu)清晰，透明度好

圖3骨髓免疫組化染色：A.TdT；B.CD20；C.CD56；D.Kappa，EnVision兩步法

3 討論

骨髓組織中含有大量的磷酸鈣和碳酸鈣，在常規(guī)石蠟切片中容易造成切片破碎、刀痕嚴(yán)重等問(wèn)題，因此充分的脫鈣是制成優(yōu)質(zhì)HE切片的前提[1]。在實(shí)際工作中脫鈣時(shí)間的掌握是制片成功與否的關(guān)鍵。脫鈣時(shí)間太短時(shí)切片破碎、刀痕嚴(yán)重；脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)HE染色不佳、免疫組化染色易出現(xiàn)假陰性[3]。目前常用的脫鈣方法中，電解質(zhì)脫鈣法實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，需要安裝特殊設(shè)備；螯合劑脫鈣法對(duì)組織破壞小，但脫鈣作用異常緩慢；酸類(lèi)脫鈣法脫鈣時(shí)間短，操作簡(jiǎn)易，是臨床工作中最常用的脫鈣方法[2,6]，因此在本實(shí)驗(yàn)中選用酸類(lèi)脫鈣液。

大部分實(shí)驗(yàn)室采用的是“前脫鈣法”，也就是骨髓組織在脫水、石蠟包埋前浸泡在各類(lèi)的脫鈣液中進(jìn)行脫鈣，等脫鈣完成后再進(jìn)行脫水、石蠟包埋[7]。本實(shí)驗(yàn)采用的是“后脫鈣法”，即骨髓組織經(jīng)固定、取材、脫水、石蠟包埋后進(jìn)行蠟塊修整，充分暴露最大組織面后浸泡于2%鹽酸脫鈣液中，待脫鈣完成后進(jìn)行制片。應(yīng)用該方法進(jìn)行脫鈣后，脫鈣時(shí)間明顯縮短，若個(gè)別標(biāo)本在制片時(shí)仍有切片破碎時(shí)，只需再浸泡1～2 min即可順利完成制片，且制片效果優(yōu)良。在HE染色中，骨髓組織形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)層次分明，透明度好，達(dá)到優(yōu)質(zhì)HE染色片的要求。

有文獻(xiàn)報(bào)道酸性脫鈣液對(duì)骨髓組織抗原有一定的破壞性，長(zhǎng)時(shí)間的酸處理容易造成抗原破壞，使得免疫組化染色出現(xiàn)假陰性，進(jìn)而影響診斷[6,8]。在骨髓組織中，抗原表達(dá)情況對(duì)骨髓疾病診斷至關(guān)重要，因此脫鈣液的選擇應(yīng)該滿(mǎn)足對(duì)抗原影響小這一必要條件[1]。為了探討2%鹽酸脫鈣液對(duì)骨髓組織抗原表達(dá)情況的影響，本實(shí)驗(yàn)選取了臨床實(shí)際工作中常用的抗體，分別定位于細(xì)胞核(PAX5、TdT)、細(xì)胞質(zhì)(CD20、CD56)、細(xì)胞膜(Kappa、Lambda)。經(jīng)2%鹽酸脫鈣液處理后，PAX5、TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda在組織中表達(dá)良好，陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，背景清晰。這一結(jié)果提示低濃度、短時(shí)間的脫鈣處理，對(duì)骨髓組織抗原完整性影響小，從而避免了免疫組化假陰性的產(chǎn)生。

總之，在骨髓組織活檢中，通過(guò)2%鹽酸脫鈣液后脫鈣的處理方法，不僅能夠制出優(yōu)良的HE切片，而且低濃度、短時(shí)間的酸處理能夠最大限度的保護(hù)抗原，避免了免疫組化中假陰性的產(chǎn)生。該方法值得在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室中推廣使用。