向 涵，劉 錚，周毅彬，姚 裘，金 露，薛波新

前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病因、發(fā)病機(jī)制尚不清楚，前列腺癌的治療方式主要以手術(shù)切除為主，然而對(duì)于晚期前列腺癌尚無(wú)有效的治療方式[1]。探討前列腺癌的病因、發(fā)病機(jī)制，對(duì)治療前列腺癌靶向藥物的研發(fā)具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)是非編碼RNA領(lǐng)域的重要組成部分，其核苷酸的長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用[2-3]。近年研究顯示，lncRNA參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，如增殖、遷移、侵襲等密切相關(guān)[4]。ZBED3-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，由582個(gè)核苷酸構(gòu)成。有研究表明，ZBED3-AS1可誘導(dǎo)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成[5]。然而，ZBED3-AS1在腫瘤特別是前列腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文現(xiàn)對(duì)前列腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞中ZBED3-AS1的表達(dá)水平及高表達(dá)ZBED3-AS1對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響進(jìn)行分析，探討ZBED3-AS1是否通過(guò)吸附miR-512-5p調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定因子(DACH1)參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年9月～2018年12月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科送檢的67例前列腺癌手術(shù)標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，術(shù)后標(biāo)本立即投入液氮罐中冷凍并保持，67例患者年齡(62.16±13.42)歲，所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；表達(dá)ZBED3-AS1的質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)于上海吉瑪公司；人前列腺癌細(xì)胞株(LNCap、PC-3、DU-145、C4-2B)及永生化前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)購(gòu)于上海生命科學(xué)院細(xì)胞所；WST-1細(xì)胞增殖試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物購(gòu)于上海生工公司；KSFM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司；一抗β-Tubulin、DACH1、Cyclin B、CDK1、Twist2和EDIL-3購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將購(gòu)買(mǎi)的前列腺癌細(xì)胞株(LNCap、PC-3、DU-145、C4-2B)采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將永生化前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)采用含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度。將DU-145細(xì)胞傳代后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為陰性對(duì)照組和ZBED3-AS1組，各組細(xì)胞鋪板在6孔板中，待融合度達(dá)40%，采用Lipofectamine 2000參照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染。陰性對(duì)照組DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒，ZBED3-AS1組DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)ZBED3-AS1的質(zhì)粒。

1.2.2qRT-PCR 采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)分析RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后，采用qRT-PCR擴(kuò)增目的基因，以GAPDH為內(nèi)參分析ZBED3-AS1和DACH1 mRNA的表達(dá)，以U6為內(nèi)參分析miR-512-5p的表達(dá)，反應(yīng)條件：95 ℃ 50 s，95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。ZBED3-AS1、miR-512-5p和DACH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。ZBED3-AS1引物序列：上游5′-GCTCCTGCCTATGTCATCCT-3′；下游5′-CTCTCTTC CCGCCCTCTT-3′。GAPDH引物序列：上游5′-TCC CATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-CATCACGCCAC AGTTTCC-3′。miR-512-5p引物序列：上游5′-CACT CAGCCTTGAGGGC-3′；下游5′-CAGTGCGTGTCGTG GAGT-3′。DACH1引物序列：上游5′-GGGGCTTGC ATACGGTCTAC-3′；下游5′-CGAACTTGTTCCACA TTGCACA-3′。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.3WST-1法 采用WST-1法檢測(cè)各組DU-145細(xì)胞的增殖能力。收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DU-145細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，接種于96孔板，濃度為每孔4×103個(gè)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第1、2、3、4、5天，在每孔中加WST-1試劑，孵育3 h后使用酶標(biāo)儀分析兩組細(xì)胞每孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.4Transwell法 采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升8×104個(gè)細(xì)胞。將200 μL細(xì)胞懸液加至Transwell上室，下室加500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出上室，采用4%多聚甲醛固定，棉簽擦去上室膜未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液染色，流水洗滌，晾干后在鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.5生物信息學(xué) 使用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v3.0預(yù)測(cè)ZBED3-AS1可互補(bǔ)結(jié)合的miRNA。使用生物信息學(xué)網(wǎng)站miRTarBase預(yù)測(cè)可互補(bǔ)結(jié)合的mRNA。

1.2.6Western blot法 采用Westen blot法檢測(cè)各組DU-145細(xì)胞靶基因的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染48 h的兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度，以50 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳，采用硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂牛奶在室溫下封閉，分別與一抗β-Tubulin(稀釋比1 ∶1 000)、DACH1(稀釋比1 ∶3 000)、Cyclin B(稀釋比1 ∶3 000)、CDK1(稀釋比1 ∶1 000)、Twist2(稀釋比1 ∶1 000)和EDIL-3(稀釋比1 ∶2 000)在4 ℃下孵育并過(guò)夜；二抗在室溫下孵育，均勻滴加ECL發(fā)光液，在成像系統(tǒng)顯影并觀察，比較組間蛋白的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中ZBED3-AS1的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，ZBED3-AS1在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯降低(4.33±0.88vs0.85±0.26，t=18.79，P<0.01，圖1)，表明ZBED3-AS1可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

圖1 前列腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中ZBED3-AS1的表達(dá)與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 前列腺癌細(xì)胞株中ZBED3-AS1的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)顯示，與永生化前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1相比(1.00±0.05)，ZBED3-AS1在前列腺癌細(xì)胞株LNCap、PC-3、DU-145、C4-2B中表達(dá)量明顯降低(0.35±0.03、0.80±0.03、0.11±0.03、0.63±0.06)(P均<0.05，圖2)。以DU-145細(xì)胞下降最為顯著(P<0.01)，選擇DU-145細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 永生化前列腺上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中ZBED3-AS1的表達(dá)與RWPE-1細(xì)胞相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率與陰性對(duì)照組相比，ZBED3-AS1組DU-145細(xì)胞中ZBED3-AS1表達(dá)明顯增加(1.00±0.01vs10.54±1.01，P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.4 WST-1法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染ZBED3-AS1后在第3天DU-145細(xì)胞增殖能力開(kāi)始下降，表明ZBED3-AS1具有抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖能力(P<0.05，圖3)。

圖3 WST-1法檢測(cè)ZBED3-AS1組和陰性對(duì)照組中DU-145細(xì)胞的增殖能力與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移能力與陰性對(duì)照組相比，ZBED3-AS1組穿膜明顯減少(189.80±23.07vs93.28±13.16,P<0.01)，表明前列腺癌細(xì)胞遷移能力下降，ZBED3-AS1具有抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞遷移的作用(圖4)。

圖4 Transwell法檢測(cè)ZBED3-AS1組和陰性對(duì)照組中DU-145細(xì)胞的遷移能力與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01

2.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ZBED3-AS1的靶基因使用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v3.0預(yù)測(cè)，ZBED3-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-512-5p。使用生物信息學(xué)網(wǎng)站miRTarBase預(yù)測(cè)，miR-512-5p可互補(bǔ)結(jié)合DACH1 mRNA(圖5)。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ZBED3-AS1的靶基因

2.7 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-512-5p和DACH1 mRNA的表達(dá)miR-512-5p和DACH1 mRNA的表達(dá)與陰性對(duì)照組相比，ZBED3-AS1組DU-145細(xì)胞中miR-512-5p的表達(dá)明顯降低(1.00±0.01vs0.23±0.03,P<0.01)。與陰性對(duì)照組相比，ZBED3-AS1組DU-145細(xì)胞中DACH1 mRNA的表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯增加(1.00±0.05vs5.69±0.57,P<0.01)。

2.8 Western blot法檢測(cè)各組DU-145細(xì)胞靶基因的表達(dá)Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，ZBED3-AS1組DACH1蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK1和Cyclin B表達(dá)明顯降低，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白Twist2和EDIL-3表達(dá)明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測(cè)ZBED3-AS1組和陰性對(duì)照組中DU-145細(xì)胞靶基因的表達(dá)

3 討論

lncRNA在人類(lèi)基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中占主要部分，可發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、劑量補(bǔ)償效應(yīng)等作用機(jī)制[6-7]。lncRNA在惡性腫瘤發(fā)病中的調(diào)控作用有助于了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，lncRNA已成為尋找診斷腫瘤的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的重要方向[8]。近年lncRNA在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制研究倍受關(guān)注。lncRNA如SChLAP1、PART1、NEAT1、ANRIL、MYU等被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，與前列腺癌的TNM分期和預(yù)后相關(guān)，對(duì)前列腺癌分子靶向藥物的研發(fā)具有重要意義[9-13]。ZBED3-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，僅在滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞中被報(bào)道研究，其在腫瘤尤其是前列腺癌中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)對(duì)前列腺癌組織和前列腺癌細(xì)胞中ZBED3-AS1水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織和前列腺癌細(xì)胞中ZBED3-AS1水平降低，表明ZBED3-AS1可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)ZBED3-AS1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DU-145細(xì)胞后，ZBED3-AS1的表達(dá)呈高表達(dá)，細(xì)胞增殖和遷移能力被明顯抑制，表明高表達(dá)ZBED3-AS1可抑制DU-145細(xì)胞的增殖和遷移能力。有研究發(fā)現(xiàn)，部分lncRNA攜帶特定miRNA的“種子序列”，發(fā)揮“海綿作用”吸附miRNA[14]。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致其降解或者直接抑制其翻譯，下調(diào)靶基因的表達(dá)[15]。lncRNA通過(guò)結(jié)合miRNA，進(jìn)而阻止miRNA與靶基因mRNA的結(jié)合[16]。本實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v3.0預(yù)測(cè)，ZBED3-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-512-5p。使用生物信息學(xué)網(wǎng)站miRTarBase預(yù)測(cè)，miR-512-5p可互補(bǔ)結(jié)合DACH1 mRNA。qRT-PCR檢測(cè)表明，高表達(dá)ZBED3-AS1后，miR-512-5p表達(dá)降低，ZBED3-AS1可能具有吸附miR-512-5p的作用。miR-512-5p表達(dá)降低后，DACH1 mRNA的表達(dá)增加，表明ZBED3-AS1可能通過(guò)吸附miR-512-5p，促進(jìn)DACH1基因的表達(dá)。DACH1基因位于染色體13q22，DACH1參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化、黏附等細(xì)胞活動(dòng)，是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[17]。DACH1在大多數(shù)正常組織中均表達(dá)，然而在很多惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)降低或缺失[18-20]。Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，DACH1蛋白表達(dá)增加后，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK1和Cyclin B的表達(dá)降低，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白Twist2和EDIL-3表達(dá)明顯下降。上述結(jié)果表明，ZBED3-AS1可能通過(guò)下調(diào)miR-512-5p的表達(dá)，上調(diào)DACH1基因的表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)下一步將構(gòu)建ZBED3-AS1慢病毒載體，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察ZBED3-AS1在體內(nèi)的抑癌作用，進(jìn)一步探討ZBED3-AS1作用機(jī)制。

綜上所述，lncRNA ZBED3-AS1在前列腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，高表達(dá)lncRNA ZBED3-AS1可通過(guò)吸附miR-512-5p，促進(jìn)DACH1的表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。lncRNA ZBED3-AS1有望成為前列腺癌診斷標(biāo)志物和分子治療靶標(biāo)。