傅 優(yōu)，鄭 洪，黃佳佳，陶貴珠

用的孕激素受體膜成分(progesterone receptor membrane components,PGRMCs)的表達(dá)和功能上[4]。孕激素受體膜成分2(progesterone receptor membrane component 2, PGRMC2)是PGRMCs中的一員。Albrecht等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中PGRMC2的高表達(dá)可抑制其遷移，而降低PGRMC2表達(dá)水平可促進(jìn)其遷移。Jühlen等[6]提出PGRMC2的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用可能由孕激素介導(dǎo)。另外，研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌在發(fā)生、發(fā)展過程中存在Wnt信號通路的異常激活，其中Wnt信號通路相關(guān)蛋白β-catenin表達(dá)明顯升高[7]。Wnt/β-catenin信號通路的激活促進(jìn)了癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，從而增強(qiáng)了腫瘤的轉(zhuǎn)移能力[8]。但是，在卵巢癌中孕激素是否通過PGRMC2介導(dǎo)影響卵巢癌的遷移和侵襲及其與Wnt信號通路的關(guān)系尚未見報道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度孕激素作用于卵巢癌細(xì)胞，探討其對卵巢癌遷移、侵襲的影響及可能機(jī)制，為開發(fā)有效的卵巢癌治療策略和控制其轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞系分別購于南京凱基生物公司、江蘇齊氏生物公司；BI胎牛血清購于以色列Biological Industries公司；孕激素購于中國Med Chem Express公司；CCK-8試劑盒購于上海Beyotime公司；Transwell小室購于Costar公司；Matrigel基質(zhì)膠購于BD Biocoat；PGRMC2單克隆抗體購于Santa Cruz公司，鼠抗人內(nèi)參GAPDH一抗購于上海Beyotime公司，β-catenin單克隆抗體購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人卵巢癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞均在含10%胎牛血清、10 000 μ/mL青霉素、10 000 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2相對飽和濕度條件中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合度達(dá)80%左右進(jìn)行消化、傳代。

1.2.2CCK-8法 采用CCK-8法測定孕激素對卵巢癌細(xì)胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的SKOV3、HO-8910細(xì)胞，以每孔5×103個接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2相對飽和濕度條件中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合度達(dá)70%～80%，加入不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白組和對照組。作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每孔的光密度(OD)值。

1.2.3Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 于小室板下室中加入550 μL的10%含血清培養(yǎng)基，上室(不含基質(zhì)膠)加入100 μL無血清的細(xì)胞懸液(濃度為每毫升5×104個細(xì)胞)及不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，各個藥物濃度均由無血清培養(yǎng)基稀釋而成。每個藥物濃度做3個復(fù)孔，并設(shè)置對照組(100 μL無血清培養(yǎng)基與100 μL的細(xì)胞懸液吹打混勻加入Transwell上室)，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育48 h。取出小室板進(jìn)行固定染色，中性樹膠封固，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張載玻片隨機(jī)拍取5個視野，記下每個視野的細(xì)胞數(shù)并取均值記為一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 除于小室板上室包被、水化基質(zhì)膠外，其余步驟均與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5Western blot法 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶的80%后分別加入同等體積、不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，并設(shè)置對照組。作用48 h后將細(xì)胞取出加入裂解液提取蛋白，通過BCA法進(jìn)行蛋白定量。配膠、上樣、電泳、切膠及電轉(zhuǎn)，于5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗PGRMC2(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶7 500)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗孵育2 h，TBST充分洗膜。采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度孕激素作用卵巢癌細(xì)胞SKOV3及HO-8910后對細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用CCK-8法檢測不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素分別作用SKOV3、HO-8910細(xì)胞24、48、72 h后觀察細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，孕激素可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，呈濃度-時間依賴性下降，且對HO-8910細(xì)胞抑制增殖的作用較SKOV3細(xì)胞明顯(P<0.05，圖1)。同一時間不同濃度(10、20、40 μmol/L)孕激素處理SKOV3、HO-8910細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各實(shí)驗(yàn)組間存活率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(除外孕激素濃度為10、20 μmol/L作用SKOV3細(xì)胞24 h)。同一濃度不同時間(24、48、72 h)孕激素處理SKOV3、HO-8910細(xì)胞后，結(jié)果顯示隨著藥物作用時間的延長，孕激素對細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，各實(shí)驗(yàn)組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(除外10 μmol/L孕激素作用SKOV3細(xì)胞24～48 h、作用HO-8910細(xì)胞48～72 h)。孕激素作用48 h后，可明顯抑制兩組細(xì)胞株的增殖，且兩株細(xì)胞間細(xì)胞存活率相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，采用作用時間為48 h的孕激素用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度孕激素作用卵巢癌細(xì)胞SKOV3及HO-8910后對細(xì)胞遷移及侵襲的影響應(yīng)用Transwell法檢測不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素作用SKOV3、HO-8910細(xì)胞48 h后細(xì)胞的遷移及侵襲能力。結(jié)果顯示，SKOV3、HO-8910細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量對照組明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)(圖2A、B)。同種細(xì)胞，癌細(xì)胞的遷移能力隨著孕激素濃度的升高而減弱，呈劑量依賴性，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(除外孕激素濃度為10～20 μmol/L)。相同的藥物作用時間及濃度，SKOV3穿過小室的細(xì)胞數(shù)量與HO-8910相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果表明，孕激素可抑制SKOV3、HO-8910細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度孕激素對卵巢癌SKOV3(A)、HO-8910(B)細(xì)胞增殖的影響

2.3 Western blot法檢測不同濃度孕激素作用卵巢癌細(xì)胞SKOV3及HO-8910后對細(xì)胞中PGRMC2和β-catenin蛋白表達(dá)的影響運(yùn)用不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素作用SKOV3、HO-8910細(xì)胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示，SKOV3及HO-8910細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組PGRMC2蛋白表達(dá)水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。HO-8910細(xì)胞的對照組及實(shí)驗(yàn)組PGRMC2蛋白相對表達(dá)量較SKOV3高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SKOV3及HO-8910細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組β-catenin蛋白表達(dá)水平與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著孕激素濃度的增加，β-catenin的表達(dá)降低，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(除外孕激素濃度為10～20 μmol/L)，且SKOV3細(xì)胞的對照組及實(shí)驗(yàn)組β-catenin蛋白表達(dá)水平較HO-8910高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，孕激素對PGRMC2蛋白表達(dá)無影響，但可下調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)水平，且隨著孕激素濃度的增加，這種下調(diào)作用更加明顯。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度孕激素對卵巢癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)能力的影響與同種細(xì)胞株中對照組相比，*P<0.05；與同種細(xì)胞株中濃度10、20 μmol/L相比，#P<0.05

圖3 Western blot法檢測不同濃度孕激素作用卵巢癌細(xì)胞SKOV3及HO-8910后細(xì)胞中PGRMC2和β-catenin蛋白的表達(dá)水平

與同種細(xì)胞株中對照組相比，*P<0.05；與同種細(xì)胞株中濃度10、20 μmol/L相比，#P<0.05

3 討論

由于卵巢癌早期缺乏有效的診療方法，常于轉(zhuǎn)移階段被診斷出來。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因。大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)女性口服避孕藥和妊娠可降低卵巢癌的發(fā)病率，常規(guī)服用含孕激素的口服避孕藥可降低30%的卵巢癌風(fēng)險[9]。但孕激素對卵巢癌保護(hù)作用的分子機(jī)制至今尚不清楚。

近年來有研究顯示[10]，孕激素可通過降低ADP-核糖基化因子6(ARF6)、神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育性下調(diào)基因9(NEDD9)及膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)3種蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)侵入性偽足(invadopodia)的形成，最終抑制子宮內(nèi)膜癌的遷移和侵襲。另有研究認(rèn)為[11]孕激素可通過抑制TGF-β/SMAD信號傳導(dǎo)途徑來減弱子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。眾所周知，TGF-β可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，部分原因是其可促進(jìn)EMT[12]。TGF-β通過SMAD2/3的直接磷酸化，活性SMAD復(fù)合物的核轉(zhuǎn)位以及隨后與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來觸發(fā)EMT。Bokhari等[11]研究顯示，孕激素通過上調(diào)E-cadherin和下調(diào)vimentin的表達(dá)來抑制EMT，最終降低子宮內(nèi)膜癌的遷移、侵襲能力。這與Jeon等[13]提出的觀點(diǎn)一致，認(rèn)為孕激素通過改變EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。以上研究均提示了孕激素可能會抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲，但孕激素是否影響卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲及其機(jī)制鮮有報道。

本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的孕激素作用于卵巢癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。CCK-8結(jié)果顯示，孕激素(10～40 μmol/L)作用24、48、72 h后均可抑制兩株細(xì)胞的增殖。綜合兩株細(xì)胞的增殖情況，實(shí)驗(yàn)采用作用時間為48 h的孕激素用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，孕激素作用后的細(xì)胞遷移能力較對照組明顯降低，且隨著孕激素濃度的增加，同種細(xì)胞的遷移、侵襲能力降低，呈劑量依賴性。這提示孕激素可抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，但其影響卵巢癌遷移、侵襲能力的相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚。

EMT是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要階段，其中上皮細(xì)胞失去細(xì)胞內(nèi)黏附和細(xì)胞極性，并增強(qiáng)其運(yùn)動性和侵入性，成為間充質(zhì)細(xì)胞。EMT過程調(diào)節(jié)多種蛋白的表達(dá)，如增加間充質(zhì)標(biāo)志物vimentin的表達(dá)，減少上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活已被指出參與多種腫瘤的發(fā)生[7]。該通路的激活促進(jìn)了癌細(xì)胞中EMT的過程，為腫瘤提供了更強(qiáng)的生存和轉(zhuǎn)移能力[14]。β-catenin是Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白。在Wnt信號存在和E-cadherin缺失的情況下，β-catenin在胞質(zhì)中的積累，隨后是胞核中的易位和活化，并激活EMT促進(jìn)因子的表達(dá)，癌細(xì)胞之間的黏附性降低，這是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[15-16]。Bokhari等[11]提出孕激素可抑制EMT從而影響子宮內(nèi)膜癌的遷移及侵襲。因此，作者推測孕激素是否通過抑制Wnt信號通路來影響卵巢癌細(xì)胞的遷移及侵襲。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用Western blot法檢測不同濃度孕激素作用于SKOV3、HO-8910細(xì)胞后β-catenin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著孕激素濃度的增加，β-catenin蛋白表達(dá)逐漸降低，呈劑量依賴性。這提示孕激素可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來降低卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

PGRMC2是新近來發(fā)現(xiàn)的一種小分子蛋白，屬于孕激素受體膜成分家族的成員[17]。有幾項(xiàng)研究結(jié)果指出，PGRMC2可能在腫瘤中發(fā)揮作用。在子宮頸腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，大量PGRMC2的丟失提示PGRMC2可能在子宮頸腺癌轉(zhuǎn)移中起腫瘤抑制因子的作用[17]。此外，Albrecht等[5]研究表明PGRMC2在SKOV3細(xì)胞中的升高導(dǎo)致較低的遷移率，而降低PGRMC2水平導(dǎo)致較高的遷移率。關(guān)于PGRMC2影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制有研究顯示[5]，G-actin單體和F-actin多聚體的比例與細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān)，并且具有侵襲性的腫瘤細(xì)胞顯示出與肌動蛋白聚合相關(guān)的信號通路的改變。此外，有文獻(xiàn)顯示類固醇激素信號傳導(dǎo)可引起肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組，這表明PGRMC2作為推定的孕酮受體可能通過肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組介導(dǎo)細(xì)胞的遷移、侵襲作用。有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞中長期使用睪酮刺激可出現(xiàn)肌動蛋白的解聚。相反，細(xì)胞短時間暴露于睪酮會導(dǎo)致肌動蛋白聚合，這些作用是由睪酮膜受體介導(dǎo)的。但Albrecht等的研究中未檢測到肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組參與PGRMC2的遷移調(diào)節(jié)作用，他們推測PGRMC2可能通過作用一系列的細(xì)胞黏附分子來影響細(xì)胞遷移?？傊?，PGRMC2影響遷移的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步深入探究。

本實(shí)驗(yàn)選取兩株人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞，運(yùn)用不同濃度的孕激素作用于細(xì)胞并檢測其PGRMC2表達(dá)情況。據(jù)了解，不同分化程度的卵巢癌中是否存在PGRMC2表達(dá)變化，國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)首次探究了PGRMC2蛋白在卵巢癌SKOV3、HO-8910細(xì)胞中的表達(dá)情況。Western blot法顯示，PGRMC2在兩株癌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中HO-8910細(xì)胞的PGRMC2蛋白相對表達(dá)量較SKOV3顯著升高。另外還發(fā)現(xiàn)，不同濃度孕激素處理后兩株細(xì)胞的PGRMC2蛋白表達(dá)不受影響。但β-catenin蛋白表達(dá)降低，且β-catenin蛋白在PGRMC2表達(dá)較高的HO-8910中調(diào)節(jié)得更明顯。由于細(xì)胞對孕激素的反應(yīng)取決于孕酮受體，這提示在卵巢癌細(xì)胞中存在功能性孕酮受體。由于本實(shí)驗(yàn)未采用siRNA技術(shù)沉默PGRMC2來觀察Wnt/β-catenin相應(yīng)蛋白有無變化，因?yàn)闊o法確切說明Wnt/β-catenin信號通路組分的改變是由PGRMC2特異性介導(dǎo)的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對于PGRMC2表達(dá)較低的SKOV3細(xì)胞來說，孕激素抑制PGRMC2表達(dá)較高的HO-8910細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力更強(qiáng)。這種作用可能由PGRMC2介導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)Wnt通路引起EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、β-catenin的改變從而影響卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。然而，卵巢癌細(xì)胞中存在多種信號通路的異常活化，其中包括PI3K/Akt、TGF-β/SMAD等通路。有研究表明[13]，孕激素通過調(diào)節(jié)PIK3/AKT信號通路增加腫瘤抑制基因nm23-H1的表達(dá)從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲?？梢娐殉舶┺D(zhuǎn)移的機(jī)制并非是單個通路發(fā)揮作用，其可能是多個通路相互影響。另外，孕激素各個類型的受體(PGRMC1、PGRMC2、PR/A、PR/B)之間的相互作用仍不清楚。因此需進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)來了解各個通路之間的相互作用。