吳 宇 葉 金 李 麗 何建洪 張 峰 李 森 軒志宏 崔 華 王松雪 馬海華

(糧油質(zhì)量安全研究所；國(guó)家糧食與物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院1，北京 100000) (?？苾x器(廈門(mén))有限公司2，廈門(mén) 361000) (河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院3，鄭州 450000)

葉金，男，1988年出生，助理研究員，糧油質(zhì)量安全檢測(cè)

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌產(chǎn)生的具有類(lèi)雌激素作用的一類(lèi)真菌毒素[1]，廣泛存在于玉米、小麥、高粱等糧谷類(lèi)作物中。誤食玉米赤霉烯酮會(huì)產(chǎn)生急慢性中毒，如動(dòng)物雌激素水平提高，動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、畸形等生殖異常，還具有肝毒性、免疫毒性及細(xì)胞毒性等[2-4]。玉米赤霉烯酮的污染受到世界各國(guó)的重視，GB/T 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[5]規(guī)定了玉米、小麥中玉米赤霉烯酮最高限量為60 μg/kg。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法主要有薄層色譜法[6]、免疫親和層析熒光光度法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]、免疫膠體金快速測(cè)定法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10,11]、高效液相色譜法[12-14]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]等。薄層色譜法檢測(cè)步驟煩瑣，重現(xiàn)性差，靈敏度低。免疫親和層析熒光光度法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金試紙條法屬于快檢方法，適用于糧庫(kù)、企業(yè)等收糧過(guò)程的簡(jiǎn)單篩查。高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精確定量。但現(xiàn)有普遍使用的免疫親和柱層析高效液相色譜法存在前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，人為因素引入誤差和錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)高，對(duì)人員技術(shù)水平要求高，人員暴露在真菌毒素和試劑污染環(huán)境中時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。

本研究將針對(duì)免疫親和柱層析高效液相色譜法檢測(cè)真菌毒素存在的弊端，結(jié)合全自動(dòng)固相萃取技術(shù)，開(kāi)發(fā)自動(dòng)免疫親和柱凈化-高效液相色譜檢測(cè)糧油中真菌毒素的方法，系統(tǒng)考察其方法性能，并與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比。本方法簡(jiǎn)單、快速、通量高適用于大批量糧油中玉米赤霉烯酮的精準(zhǔn)測(cè)定，將為糧油中玉米赤霉烯酮檢測(cè)和污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Fotector Plus全自動(dòng)固相萃取儀；I-Class高效液相色譜儀；AutoEVA-60全自動(dòng)濃縮氮吹儀；甲醇、乙腈；PBS鹽包、吐溫-20；超純水；Evergreen TREA玉米赤霉烯酮免疫親和柱； 國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲醇中玉米赤霉烯酮[GBW(E)100301]，玉米全粉玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100385]，質(zhì)控樣品全麥粉中玉米赤霉烯酮、玉米油中玉米赤霉烯酮、大米粉中玉米赤霉烯酮、玉米全粉空白。

1.2 儀器條件

色譜條件：Waters BEH-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫：35 ℃；流動(dòng)相:乙腈∶水∶甲醇(46∶46∶8)等梯度洗脫。流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。激發(fā)波長(zhǎng)303 nm；發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.3 樣品前處理方法

全自動(dòng)固相萃取前處理法：準(zhǔn)確稱(chēng)取(5±0.01)g樣品，加入20 mL 90%乙腈水，渦旋提取20 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入20 mL 0.1%吐溫-20的PBST緩沖液，7 000 r/min離心5 min，取10 mL過(guò)濾液于50 mL離心管內(nèi)，置于80 mL上樣架上，運(yùn)行編好的儀器方法對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)凈化(具體步驟詳見(jiàn)表1，序號(hào)1-2進(jìn)行管路清洗，防止之前樣品污染；序號(hào)3進(jìn)行樣品液過(guò)柱，序號(hào)4進(jìn)行親和柱淋洗，序號(hào)5-7進(jìn)行淋洗液排空、親和柱吹干；序號(hào)8用甲醇對(duì)管路進(jìn)行置換，防止淋洗液殘留影響洗脫效果，序號(hào)9-11進(jìn)行親和柱洗脫，并在收集盤(pán)進(jìn)行收集)。將洗脫液轉(zhuǎn)移到全自動(dòng)氮吹儀內(nèi)于55 ℃以下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，供液相色譜測(cè)定。

GB 5009.209—2016前處理方法：稱(chēng)取(40.0±0.1)g粉碎試樣于均質(zhì)杯中，加入4 g氯化鈉和100 mL 90%乙腈水，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min，定量濾紙過(guò)濾。移取10.0 mL濾液加入40 mL水稀釋混勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清，濾液備用。將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取10.0 mL(相當(dāng)于0.8 g樣品)中的濾液，注入玻璃注射器中。 將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以1～2滴/s的流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至有部分空氣進(jìn)入親和柱中。 用5 mL水淋洗柱子1次，流速為1～2滴/s，直至有部分空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液。準(zhǔn)確加入1.5 mL甲醇洗脫，流速約為1滴/s。 收集洗脫液于玻璃試管中，于55 ℃以下氮?dú)獯蹈珊?，?.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，供液相色譜測(cè)定。

表1 全自動(dòng)固相萃取步驟

2 結(jié)果與討論

2.1 上樣流速優(yōu)化

為了縮短上樣時(shí)間，同時(shí)保證毒素全部吸附到免疫親和柱上，考察玉米基質(zhì)加標(biāo)稀釋液在上樣流速為1、2、3、4、5 mL/min時(shí)的柱回收率，結(jié)果如圖1所示，流速為1～5 mL/min時(shí)，回收率在95.8%～100.7%，RSD在1.7%～6.2%，均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求。但是4 mL/min時(shí)開(kāi)始回收率有一定的下降趨勢(shì)，因此選擇3 mL/min的流速，即保證時(shí)效性又保證回收率最佳。

圖1 上樣流速對(duì)ZEN回收率的影響

2.2 氣推次數(shù)的優(yōu)化

氣推程序通過(guò)快速加壓將柱子內(nèi)殘留的液體排出，淋洗之后，柱子內(nèi)的殘留液體是否排干會(huì)影響氮吹的時(shí)間以及洗脫效果，因此需要對(duì)氣推次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確保柱子吹干，結(jié)果如圖2所示，以80 mL/min流速氣推3次后柱子質(zhì)量變化不顯著，說(shuō)明氣推3次后柱子已吹干。

圖2 氣推次數(shù)對(duì)柱子吹干情況的影響

2.3 方法線(xiàn)性、檢出限及定量限

按照逐級(jí)稀釋法配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按照樣品前處理方法對(duì)空白樣品進(jìn)行處理獲得空白基質(zhì)液，采用空白基質(zhì)液逐級(jí)稀釋方法獲得玉米赤霉烯酮的檢出限(LOD，S/N≥3)和定量限(LOQ，S/N≥10)。結(jié)果見(jiàn)圖3，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為7 μg/kg，定量限為20 μg/kg，均滿(mǎn)足日常檢測(cè)需要。

圖3 玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 日內(nèi)精密度及回收率

采用本方法和國(guó)標(biāo)方法GB 5009.209—2016分別對(duì)配制的高、中、低三個(gè)濃度梯度的玉米加標(biāo)樣品進(jìn)行雙試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，GB 5009.209—2016和本方法的回收率在99.0%～112.5%，RSD值在

圖4 本方法和國(guó)標(biāo)方法在玉米樣品中加標(biāo)回收率對(duì)比

1.5%～3.2%范圍內(nèi)，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求。采用配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異，30 μg/kg的td=0.22，60 μg/kg的td=1.84, 120 μg/kg的td=1.95，均小于查表所得的t0.05,5=2.57，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法無(wú)顯著性差異。

2.5 日間精密度及回收率考察

分別采用本方法和國(guó)標(biāo)方法每3 h測(cè)定中濃度加標(biāo)樣品一次，連續(xù)測(cè)定18次，結(jié)果見(jiàn)圖5，國(guó)標(biāo)方法的日間平均回收率為105.6%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%，全自動(dòng)固相萃取儀的日間平均回收率為104.2%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%均滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)規(guī)定的回收率和穩(wěn)定性要求。按照GB/T 4889—2008《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋 正態(tài)分布均值和方差的估計(jì)與檢驗(yàn)》中7.1單總體方差或標(biāo)準(zhǔn)差檢驗(yàn)實(shí)施X2分布檢驗(yàn)，判斷該方法重復(fù)性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差是否超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，同時(shí)采用18次極差與現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的18次測(cè)定重復(fù)性臨界極差進(jìn)行對(duì)照，考察該方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)差和18次測(cè)定極差均未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的精密度要求，穩(wěn)定性滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)要求。

圖5 本方法和國(guó)標(biāo)法連續(xù)測(cè)定18次的加標(biāo)回收率

2.6 臺(tái)間差考察

為了考察儀器的穩(wěn)定性，隨機(jī)選擇兩臺(tái)設(shè)備分別對(duì)全麥粉玉米赤霉烯酮、玉米油玉米赤霉烯酮、大米粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品進(jìn)行雙試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。采用配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩臺(tái)設(shè)備的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異，兩臺(tái)儀器測(cè)定全麥粉玉米赤霉烯酮的td為0.578 7，玉米油玉米赤霉烯酮的td為0.997 2，大米粉玉米赤霉烯酮的td為1.753 4，均小于查表值t0.05,5為2.570 6，因此兩臺(tái)儀器不存在顯著性差異。

圖6 2臺(tái)儀器對(duì)3種質(zhì)控物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

2.7 方法的準(zhǔn)確性考察

使用兩臺(tái)設(shè)備對(duì)玉米全粉玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100385]、全麥粉玉米赤霉烯酮、玉米油玉米赤霉烯酮、大米粉玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表2，儀器1和儀器2所有結(jié)果均落在有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)賦值范圍內(nèi)。

表2 2臺(tái)儀器對(duì)4種有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

2.8 儀器空白考察

隨著全自動(dòng)固相萃取儀器使用次數(shù)的增加，有可能會(huì)有玉米赤霉烯酮?dú)埩舻那闆r。因此每天進(jìn)樣前和處理完成之后對(duì)儀器空白的監(jiān)測(cè)非常必要。圖7是連續(xù)6 d的儀器空白與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比色譜圖，可以看出儀器無(wú)殘留現(xiàn)象。

圖7 儀器空白與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比圖

3 結(jié)論

通過(guò)本方法對(duì)6個(gè)樣品從上樣到洗脫完成的前處理時(shí)間為35 min，檢出限為7 μg /kg，定量限為20 μg /kg，相關(guān)系數(shù)為 0.999 5，加標(biāo)回收率為99.0%～110.4%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～2.1%(n=6)，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%(n=18)，測(cè)定4種質(zhì)控物質(zhì)的結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)示值范圍內(nèi)，無(wú)顯著臺(tái)間差，無(wú)儀器殘留。本方法能夠最大限度地減少實(shí)驗(yàn)人員工作量，提高工作效率，避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，降低實(shí)驗(yàn)人員暴露在真菌毒素和有機(jī)試劑中的風(fēng)險(xiǎn)，可用于大量糧油樣品中玉米赤霉烯酮的精準(zhǔn)測(cè)定。