葉貝華，傅 明，何錦添，陳順金, 蔣 迪

(廣東省東莞市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科, 廣東 東莞 523000)

鼻咽癌是我國常見的一種頭頸部惡性腫瘤，尤其高發(fā)于南方地區(qū)，其病理類型以未分化癌和低分化癌為多見，而放射治療是目前臨床采用的治療方法[1]。研究指出，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在鼻咽癌患者血清中的水平明顯升高，其與患者病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在密切關(guān)系[2]。研究報道，zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)可通過結(jié)合血管抑制蛋白1的啟動子而阻滯該蛋白表達，并進一步促使VEGF表達水平升高，從而誘導腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生[3]。作為首個新發(fā)現(xiàn)的反式調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA，Hox轉(zhuǎn)錄反義RNA(Hox transcript antisense RNA,HOTAIR)高表達于頭頸部腫瘤。為此，本研究通過檢測鼻咽癌患者VEGF、EZH2和HOTAIR的表達情況，并進一步探討HOTAIR表達水平與患者預后狀況的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:采用回顧性研究，收集2016年6月至2019年6月本院72例鼻咽癌(鼻咽癌組)和54例鼻咽慢性炎癥(對照組)患者的臨床資料。納入標準：鼻咽癌組患者均經(jīng)鼻咽活檢和病理檢查證實為鼻咽癌，初治；對照組均由于淋巴組織增生而行鼻咽活檢，且經(jīng)病理檢查證實為鼻咽慢性炎癥。排除標準：伴有其它全身其它惡性腫瘤；復發(fā)性鼻咽癌；臨床資料不全。其中，鼻咽癌組男57例(79.17%)，女15例(20.83%)；年齡20～74歲，平均(49.97±8.73)歲。對照組男39例(72.22%)，女15例(27.78%)；年齡21～72歲，平均(46.50±9.17)歲。兩組患者性別和年齡的比較，均無明顯差異(均P>0.05)。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學法的檢測:通過免疫組織化學法檢測兩組VEGF和EZH2蛋白表達情況，方法如下：取患者鼻咽組織，經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切片，行免疫組織化學檢測。根據(jù)著色深度，分為0分：無著色；1分：著色不明顯；2分：著色中等；3分：著色程度強；根據(jù)陽性細胞比例，分為0分：無陽性細胞；1分：陽性細胞數(shù)比例低于50%；2分：陽性細胞數(shù)比例51%～75%；3分：陽性細胞數(shù)比例>75%。以著色程度評分與陽性細胞比例評分之和為總分。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應的檢測:采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測患者VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA的表達情況，方法如下：根據(jù)Trizol試劑盒(美國Ambion公司)提取兩組鼻咽組織總RNA，測定RND濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promege公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。對引物序列進行設計，以GAPDH為內(nèi)參照，行實時熒光定量聚合酶鏈反應。反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s,72℃延伸30s，共進行40個循環(huán)。以2-△△Ct法對VEGF、EZH2、HOTAIR mRNA相對表達量進行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 鼻咽癌組與對照組患者VEGF和EZH2蛋白免疫組織化學評分的比較:鼻咽癌組VEGF和EZH2蛋白均明顯高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 鼻咽癌組與對照組患者VEGF和EZH2蛋白免疫組織化學評分的比較分)

2.2 鼻咽癌組與對照組VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA表達情況的比較:相比對照組，鼻咽癌組VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA相對表達量均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 鼻咽癌組與對照組VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA表達情況的比較

2.3 HOTAIR mRNA表達與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關(guān)性:采用2-△△Ct法計算HOTAIR mRNA相對表達量，結(jié)果顯示HOTAIR mRNA在鼻咽癌組的相對表達量中位數(shù)為6.12，以該值作為界值，分為低表達組(HOTAIR mRNA<6.12)36例和高表達組(HOTAIR mRNA≥6.12)36例。結(jié)果顯示，不同病理分級、N分期、M分期、近期療效的患者HOTAIR mRNA表達情況的比較，均存在明顯差異(P<0.05)；兩組年齡、性別、病理類型的比較，均無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 不同特征的患者HOTAIR mRNA表達情況的比較n(%)

3 討 論

馬賽[4]等研究顯示，VEGF蛋白在涎腺黏液表皮樣癌中的陽性表達率較正常涎腺組織明顯升高，并且其表達陽性率與涎腺黏液表皮樣癌TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。高立生[5]等研究表明，VEGF高表達于喉鱗癌組織；史建偉[6]等研究發(fā)現(xiàn)，VEGF高表達于胃癌組織，二者研究發(fā)現(xiàn)VEGF高表達在喉鱗癌和胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進作用。殷偉杰[7]研究報道，EZH2蛋白和mRNA均異常高表達于腎癌組織，并且其高表達于患者預后不良密切相關(guān)。另有研究顯示，VEGF高表達于肺癌組織[8]，而EZH2高表達于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤組織[9]，且二者表達量往往與癌細胞增殖、侵襲能力均密切相關(guān)。張樂[10]研究發(fā)現(xiàn)，EZH2阻滯劑DZNep具有阻滯食管鱗癌移植瘤增長的作用，同時可促進腫瘤細胞凋亡。隨著近年來對長鏈非編碼RNA與腫瘤病理過程相關(guān)性的研究不斷深入，已有研究表明HOTAIR與多種惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)，如胃癌和乳腺癌等[11]。并且，HOTAIR可通過募集染色質(zhì)修飾復合體2、組蛋白去甲基化酶1蛋白復合體，發(fā)揮調(diào)控p53、Akt、Wnt等多種信號通路的作用，并且其異常表達具有影響頭頸部腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、細胞周期及新生血管形成等作用[12]。有關(guān)HOTAIR誘導腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的分子機制研究表明，HOTAIR的5端可通過結(jié)合染色質(zhì)修飾復合體2蛋白復合物，使其果蠅EZH2蛋白介導H3組蛋白27位賴氨酸的甲基化，促使染色質(zhì)構(gòu)型改變，促進染色質(zhì)的表觀遺傳沉默[13]。

陳文慧[14]等研究報道，HOTAIR高表達于鼻咽癌組織，且其表達水平與患者N分期有關(guān)，同時與患者預后不良密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組VEGF和EZH2蛋白表達水平均明顯高于對照組。此外，相比對照組，鼻咽癌組VEGF、EZH2和HOTAIR mRNA相對表達量均明顯升高，結(jié)果表明VEGF、EZH2和HOTAIR高表達于鼻咽癌組織，與上述研究報道相符。同時，本研究顯示，高表達組病理分級、N分期、M分期、近期療效與低表達組比較，均存在明顯差異。結(jié)果表明，HOTAIR在鼻咽癌組織中的高表達與患者預后不良、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。分析其原因，可能在于HOTAIR在鼻咽癌組織中可能通過募集EZH2而促進抑癌基因的表觀沉默，促使VEGF表達水平升高，從而起到誘導鼻咽癌腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的作用。由此推測，HOTAIR可能是預測鼻咽癌預后狀況的潛在生物學標志物，進而可能是鼻咽癌患者臨床治療的一種新靶點。

綜上所述，VEGF、EZH2和HOTAIR高表達于鼻咽癌組織，并且HOTAIR可能通過EZH2和VEGF而起到誘導鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移的作用，且與患者預后不良存在密切關(guān)系。但目前有關(guān)HOTAIR在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程中的具體作用機制尚未完全明確，需今后進一步研究和證實。