何定芬，鄭霖波，周英杰，毛鵬權(quán)，葉常青，謝超，*

（1.浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學院，浙江舟山316021；2.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316022；3.舟山市常青海洋食品有限公司，浙江舟山316022）

帶魚（Trichiurus lepturu），在我國[1]乃至全世界[2]，都是重要的經(jīng)濟魚品種，是海洋漁業(yè)中的重要組成部分[3]。帶魚不僅肉質(zhì)鮮美，口感順滑，而且富含人體所必需的各類蛋白質(zhì)，微量元素等，營養(yǎng)價值非常之高，是非常受歡迎的食品種類[4]。

我國帶魚年捕獲量達到120萬噸，其中夾帶的低值小帶魚的比例在20%以上，且舟山作為中國最大的漁場，年捕撈量巨大，所以魚類生產(chǎn)加工的原料非常豐富。目前低值小帶魚的加工方式較單一，主要是加工成飼料，缺乏高值化的加工方式，資源利用率低下，急需提高利用率[5]。目前國內(nèi)外利用水產(chǎn)品制備抗菌肽的主要原料為魷魚[6]、羅非魚[7]、大黃魚[8]等，利用低值小帶魚制備抗菌肽的研究在我國鮮見報道。

量產(chǎn)制備抗菌肽最優(yōu)的方法是酶解法，因酶解條件溫和易控制無公害，被公認為最有前景的抗菌肽制備法[9]。故本研究以低值舟山小帶魚為原料，選用復(fù)合酶解法制備小帶魚抗菌肽，通過單因素試驗確定復(fù)合酶種類，再結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，并對其純化，為小帶魚抗菌肽的制備提供理論依據(jù)，帶來一定的社會效益和經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

舟山小帶魚，購于舟山老碶菜場，購買時將小帶魚放在加碎冰的泡沫箱中保存，在40 min內(nèi)送到實驗室，人工去除帶魚頭部及內(nèi)臟組織，在高速組織搗碎機中處理，得到小帶魚糜，將小帶魚糜裝入保鮮袋中，每袋100 g，在-20℃環(huán)境下貯藏。試驗時提前24 h將小帶魚糜取出，在4℃的冰箱冷藏室中解凍備用。

試驗用酶見表1。

表1 試驗用酶Table 1 Experimental enzymes

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表2。

表2 儀器與設(shè)備Table 2 Instruments and equipment

1.3 方法

1.3.1 小帶魚抗菌肽的制備

取解凍好的舟山小帶魚糜10 g，溶于100 mL純水中，調(diào)節(jié)pH值以及溫度，到達蛋白酶的最適酶解pH值和溫度，加入0.2 g/100 mL的蛋白酶[10]；為獲得好的酶解效果，在磁力攪拌機中攪拌10 min；放入180 r/min的搖床中酶解[11]。酶解完成后將酶解液進行滅酶處理（電熱恒溫水浴，95℃～100℃，20 min）。取滅酶后酶解液進行離心處理（4℃，8 000 r/min，15 min），離心完成后將中間清液取出，利用10 mL的離心管保存，保存時的環(huán)境溫度控制在-20℃，并對其封口以防受污染，以備后續(xù)使用。

1.3.2 抑菌效果的測定

采用Dionysius DA等[12]的光密度法測定蛋白酶解液的抑菌效果，部分進行修改。選取指示菌為大腸桿菌，菌齡為18 h～24 h，菌濃度為107CFU/mL。各蛋白酶解液用0.22 μm濾膜過濾后，調(diào)節(jié)成一致濃度，各取2 mL，加入10 mL肉湯液體培養(yǎng)基中；同時加入200 μL指示菌，37℃培養(yǎng)24 h后測定其吸光值（A樣品）。不加入菌懸液，剩余條件相同的為空白樣品，測定其吸光值（A空樣）；2 mL滅菌生理鹽水代替2 mL蛋白酶解液，剩余條件相同的為對照樣品，測定其吸光值（A對照）。所有樣品均進行3次平行試驗。試驗空白調(diào)零10 mL肉湯液體培養(yǎng)基和2 mL滅菌生理鹽水混合液；測定吸光值時波長為570 nm，計算公式為式（1）：

1.3.3 酶的篩選

選用胃蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶在各蛋白酶的最適酶解條件下進行酶解，獲得酶解液。測定酶解液的抑菌率，通過對比抑菌率，選取兩種抑菌效果最好的酶作為復(fù)合酶，復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶1。最適酶解條件及添加量[13]見表3。

表3 二次酶酶解條件及添加量Table 3 Secondary enzyme enzymatic hydrolysis conditions and addition amount

1.3.4 單因素試驗

在確定復(fù)合酶的篩選后，根據(jù)1.3.1節(jié)方法制備小帶魚抗菌肽，進行3個因素的試驗：復(fù)合酶酶解時間（2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h）、復(fù)合酶酶解溫度（25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45 ℃）以及復(fù)合酶酶解pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），單獨考察上述變量下酶解液的抑菌效果，通過比較抑菌效果確定復(fù)合酶解各因素的最佳值。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

使用軟件Design-Expert 11.0進行響應(yīng)面分析，確定復(fù)合酶解過程中的最適條件。響應(yīng)面試驗三因素為復(fù)合酶解時間、溫度、pH值；響應(yīng)值為抗菌率，最終得出優(yōu)化結(jié)果。

1.3.6 水解度及蛋白質(zhì)含量測定

氨基態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法[14]，水解度計算公式為式（2）：

采用凱氏定氮法[15]測定酶解液中蛋白質(zhì)濃度，每組做3個平行試驗。

1.3.7 Sephadex G-25凝膠層析分離

最佳復(fù)合酶解條件下酶解制得小帶魚酶解液粗品，對粗品使用超濾法[16]獲得超濾樣品后用Sephadex G-25凝膠層析柱進行層析分離[17]，測定280 nm[18]處吸光值。收集每一組分進行抑菌率的測定，選取抑菌率最好的組分進行下一步純化。

1.3.8 反相高效液相色譜純化

取1.3.7節(jié)獲得的組分，采用莫加利等[19]的方法進行反相高效液相色譜純化，測定280 nm處的吸光值。對每一組分進行抑菌率測定，選取最佳組分，達到純化目的。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶酶解液對指示菌的抑菌效果見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解液對指示菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different protease hydrolysates on indicator bacteria

由圖1可知，抑菌效果最強的蛋白酶種類為胃蛋白酶，其酶解得到的小帶魚酶解液抑菌率達到33.68%；木瓜蛋白酶酶解所得的小帶魚酶解液抑菌率次之，達到15.81%；而效果較差的是胰蛋白酶酶解得到的小帶魚酶解液，抑菌率為6.42%。風味蛋白酶與堿性蛋白酶沒有表現(xiàn)出抑菌性，甚至對大腸桿菌的生長可能存在不同程度的促進作用。通過對比抑菌率，本試驗驗最終選取復(fù)合酶制劑組合為胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，以此復(fù)合酶酶解制備小帶魚抗菌肽。

2.2 單因素試驗

2.2.1 復(fù)合酶酶解時間對抑菌效果的影響

酶解條件固定值為：復(fù)合酶酶解溫度35℃，pH 4.5。自變量為復(fù)合酶酶解時間，經(jīng)過試驗測得數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)合酶酶解時間對酶解液抑菌率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibition rate of enzymatic hydrolysate

分析圖2可得，在復(fù)合酶解時間從2 h延長到4 h的過程中，酶解液抑菌率呈現(xiàn)出增長趨勢，并且在4 h的時候達到最高值，抑菌率為42.86%；出現(xiàn)此趨勢的原因是伴隨酶解時長的增加，有抑菌作用的多肽被不斷酶解出來導致的。隨著酶解時長的繼續(xù)增加，抑菌效果較明顯的下降，酶解時間在5 h時抑菌率為37.31%；抑菌效果的衰弱可能是因為具有抑菌性的多肽分子在長時間的酶解作用下進一步縮短肽鏈，導致原本具備的抗菌性消失[20]。酶解5 h～6 h時抑菌率變化很小，原因可能是底物蛋白中能夠結(jié)合復(fù)合酶分子的所有酶切位點已被酶解，且有抗菌性的小分子肽不受復(fù)合酶酶解作用，因此抑菌性保持相對穩(wěn)定。綜上分析，復(fù)合酶解最適時間為4 h。

2.2.2 復(fù)合酶解溫度對抑菌效果的影響

酶解條件固定值為：復(fù)合酶解時間4 h；復(fù)合酶解pH3.5。自變量為復(fù)合酶解溫度，試驗測得數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖3。

圖3 復(fù)合酶酶解溫度對酶解液抑菌率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on antibacterial rate of enzymatic hydrolysate

由圖3可得，在復(fù)合酶酶解溫度從25℃升高到45℃的過程中，酶解液抑菌率呈現(xiàn)出A型趨勢，抑菌率最高值出現(xiàn)在35℃時，為44.19%。酶解溫度從25℃升高至35℃時抑菌率的上升是因為復(fù)合酶活性增強以及分子之間自由碰撞概率上升，兩者共同作用，同時促進了酶促反應(yīng)[21]；而在35℃到45℃區(qū)間內(nèi)抑菌率明顯從44.19%下降到28.23%，分析其原因是復(fù)合酶分子結(jié)構(gòu)遭到熱破壞，致使絕大部分的酶失活，進而導致了酶促反應(yīng)的停滯，所以抑菌效果顯著下滑[22]。由此，可以確定35℃是復(fù)合酶的最適酶解時間。

2.2.3 復(fù)合酶解pH值對抑菌效果的影響

酶解條件固定值為：復(fù)合酶解時間4 h、溫度35℃；自變量為胃蛋白酶酶解pH值，試驗測得數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖4。

圖4 復(fù)合酶酶解pH值對酶解液抑菌率的影響Fig.4 Effect of enzyme hydrolysis on the antibacterial rate of enzymatic hydrolysate

由圖4可得，在復(fù)合酶酶解pH值從2.5升高到4.5的過程中，酶解液抑菌率不斷增長，抑菌率最高值出現(xiàn)在pH值為4.5時，為44.24%。在pH值繼續(xù)升高至6.0時抑菌率迅速下降至21.19%，其原因可能是此時的pH值迅速遠離復(fù)合酶中胃蛋白酶的最適酶解pH值，致使胃蛋白酶大量失活，胃蛋白酶主導的酶促反應(yīng)基本停止，此時復(fù)合酶解過程中木瓜蛋白酶主導酶促反應(yīng)。而在pH值區(qū)間為6.0～6.5時，胃蛋白酶基本不進行酶促反應(yīng)，且此區(qū)間為木瓜蛋白酶作用的較適值，故而抑菌率變化較不明顯。酶在作用時，所處的環(huán)境pH值對酶活影響明顯，為了使酶活達到較高水平，應(yīng)當調(diào)整pH值至該酶最適pH值區(qū)間，加強酶促反應(yīng)中酶分子的結(jié)合能力，最終增強酶解效果[23]。由此，復(fù)合酶的最適酶解pH值確定為4.5。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，確定響應(yīng)面試驗三因素的設(shè)計水平，完成對三因素的設(shè)計方案，結(jié)合軟件給出的具體組合著手試驗操作，記錄數(shù)據(jù)。其設(shè)計方案見表4，試驗結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面設(shè)計試驗因素與水平Table 4 Response surface design test factors and levels

表5 響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果Table 5 Response surface design test results

2.3.2 回歸方程建立及方差分析

對表5中數(shù)據(jù)進行分析，參照軟件，得到三因素對抑菌率得率的二次多項回歸方程如下：

Y=44.22+1.10A+0.26B-0.373 8C+0.002 5AB-0.35AC+0.292 5BC-1.31A2-1.29B2-1.57C2

對抑菌得率的影響程度大小表現(xiàn)為式中的各項系數(shù)的絕對值；單因素的影響方向為方程中各系數(shù)的正負號。回歸方程的方差分析結(jié)果見表6。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance（ANOVA）regression equation

分析表6，模型P＜0.000 1，證明極顯著；失擬項中P=0.176 9＞0.05，F(xiàn) 值為 2.75，表明不顯著；模型的回歸系數(shù) R2=0.993 5，R2Adj=0.985 2，R2Pre=0.926 9。綜上可得，此模型擬合度較高，對響應(yīng)中的各項變異能夠解釋，故此模型對小帶魚復(fù)合酶解條件能夠很好地進行預(yù)測，能夠得出較好的結(jié)果。

PA小于0.000 1，表明這一次項達到極顯著水平，PB以及PC均小于0.05，表明這兩個一次項達到顯著水平；通過比較3個一次項A、B、C的F值大小可得，3個因素中對酶解過程的影響最大的是復(fù)合酶酶解時間，其次是復(fù)合酶解pH值，影響作用最小的是復(fù)合酶解溫度。此外，在交互項中對酶解液的抑菌性影響不顯著（P＞0.05）的項是AB，而AC和BC兩項對酶解液的抑菌性影響顯著（P＜0.05）；所有的二次項（A2、B2、C2）對酶解液的抑菌性的影響極顯著（P＜0.01）。

圖5所示的三維響應(yīng)面圖可以較直觀的闡明3個交互項（AB、AC、BC）之間的相互作用[24]。經(jīng)響應(yīng)面分析，得到最佳的小帶魚復(fù)合酶解條件為復(fù)合酶水解時間4.2 h、復(fù)合酶解溫度36.5℃、復(fù)合酶解pH值為4.4。

2.3.3 響應(yīng)面最佳條件驗證

圖5 酶解液對抑菌率的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface analysis of enzymatic hydrolysate to inhibition rate

結(jié)合實際情況下的試驗操作可行性，對小帶魚抗菌肽的制備條件進行一定程度上的修改，調(diào)整后復(fù)合酶解時間4.2 h、復(fù)合酶解溫度36.5℃、復(fù)合酶解pH4.4。最終根據(jù)此條件酶解所得酶解液抑菌率44.48%，與響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測結(jié)果相差0.8%。由此可證，該試驗設(shè)計的模型效果良好，優(yōu)化作用真實有效。對比胃蛋白酶解得到的小帶魚酶解液抑菌，抑菌率提高了24.28%，證明利用復(fù)合酶解替代單酶酶解的制備工藝行之有效，能夠獲得更佳的小帶魚抗菌肽。在最佳酶解條件下測得酶解液的水解度為32.64%，蛋白質(zhì)含量濃度為0.45 mg/mL。

2.4 Sephadex G-25凝膠層析分離

圖6所示為超濾后的樣品經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析后出現(xiàn)的3個組分，分別為T1、T2、T3。同濃度（1.0 mg/mL）[25]下測定各組分抑菌率，結(jié)果見表7。

表7 Sephadex G-25凝膠層析后各組分抑菌率對比各組分的抑菌率，選擇T2組分進行下一步純化

圖6 酶解液超濾后Sephadex G-25凝膠層析Fig.6 Sephadex G-25 gel chromatography after ultrafiltration of the enzymatic hydrolysis solution

表7 Sephadex G-25凝膠層析后各組分抑菌率Table 7 Antibacterial rate of each component after Sephadex G-25 gel chromatography

2.5 反向高效液相色譜純化

凝膠層析后樣品反向高效液相色譜純化結(jié)果見圖7，反向高效液相色譜純化后各組分抑菌率見表8。

圖7 凝膠層析后樣品反向高效液相色譜純化結(jié)果Fig.7 Purification results of samples after gel chromatography by reversed-phase high performance liquid chromatogra（RP-HPLC）

表8 反向高效液相色譜純化后各組分抑菌率Table 8 Antibacterial rate of each component after RP-HPLC purification

對圖7及表8分析得出，經(jīng)反向高效液相色譜純化后，只出現(xiàn)了兩個峰，通過測定兩者抑菌率，得出T2-1組分的抑菌率高達78.56%，相比純化前的小帶魚酶解原液，抑菌率提高了77.61%，證明純化效果顯著。

3 結(jié)論

本文以舟山小帶魚為研究對象，優(yōu)化了小帶魚抗菌肽制備工藝，同時探究其抗菌肽的抑菌效果，并對其純化。經(jīng)過試驗得出的復(fù)合酶制劑組合為胃蛋白酶加木瓜蛋白酶；通過響應(yīng)面優(yōu)化了小帶魚抗菌肽的復(fù)合酶解條件，獲得最佳酶解條件：復(fù)合酶解時間4.2 h、復(fù)合酶酶解溫度36.5℃、復(fù)合酶酶解pH值為4.4，該條件下實際測得小帶魚復(fù)合酶解液抑菌率為44.87%，相比胃蛋白酶單獨水解提高了24.28%，表明此復(fù)合酶解效果顯著，能獲得更好抑菌效果的抗菌肽。此時水解度為32.64%，蛋白質(zhì)含量濃度為0.45 mg/mL。Sephadex G-25凝膠層析分離和反向高效液相色譜純化后抑菌率為78.56%，提升了77.61%，純化效果顯著。該研究結(jié)果對酶解小帶魚制備抗菌肽的工藝及深入研究具有一定的指導意義。

本研究初步探究了小帶魚抗菌肽的制備及其抑菌效果，而該抗菌肽對其他代表性菌的抗菌效果以及抗菌機理未深入討論。在此試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究小帶魚等低值水產(chǎn)品抗菌肽，將其制成保健食品或在食品保鮮領(lǐng)域加以應(yīng)用，達到高值化利用低值小帶魚的目的，帶來一定的社會效益以及經(jīng)濟效益。