趙航軻，黃國明，2，彭浩，2，*

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

梯棱羊肚菌是一類世界分布的名貴食藥用真菌，味道鮮美、營養(yǎng)豐富，與松茸、黑松露、牛肝菌被譽(yù)為“四大珍稀食用菌”，具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值[1-5]。梯棱羊肚菌是以人工栽培的極少數(shù)羊肚菌種類之一[6]，由于基礎(chǔ)研究薄弱影響了其穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)，若前期的菌種具有活性高、成活率高適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，則為羊肚菌的馴化栽培提供了最有利條件[7]。故采用羊肚菌液體培養(yǎng)的方式，這種方式可解決食用菌對(duì)環(huán)境的依賴同時(shí)有效地提高產(chǎn)量。羊肚菌液體種與栽培種在生理功能與化學(xué)組成上相差不大，并且生長速度快、高校經(jīng)濟(jì)是一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)方式。因此，現(xiàn)在培養(yǎng)羊肚菌的主要方法是液體培養(yǎng)法。

硒是人體必需的15種微量營養(yǎng)元素之一，有機(jī)硒更易被人體而吸收，其吸收率可達(dá)70%以上。硒可以保護(hù)細(xì)胞及組織免受過氧化物損傷，維持細(xì)胞正常功能[8]。在醫(yī)學(xué)上硒可以抗氧化、清除自由基、降低血液黏度[9-10]。從我國的地理分布來看在浙江龍游、陜西南部、新疆天山北坡、江西豐城等地有較高硒含量，其他地區(qū)硒含量匱乏，所以富硒食品的開發(fā)有很重要的意義[11]。

食用菌因具有較強(qiáng)的富硒能力，是一個(gè)很好的富硒載體，可以使無機(jī)硒安全有效地轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，同時(shí)食用菌的營養(yǎng)成分因富硒得到改善[12]。羊肚菌對(duì)硒具有較強(qiáng)的富集和轉(zhuǎn)化作用，且硒多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力[13-14]，硒化修飾的羊肚菌蛋白的總抗氧化活性是羊肚菌蛋白的1.33倍，對(duì)ABTS自由基、羥基自由基和H2O2的清除活性分別比羊肚菌蛋白提高了71.62%，11.11%和18.26%[15]。本研究通過單因素及正交試驗(yàn)對(duì)羊肚菌最佳富硒濃度及富硒條件進(jìn)行研究，為富硒羊肚菌液體菌種制備及羊肚菌富硒液體深層發(fā)酵提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：梯棱羊肚菌（Morchella sextelata），由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18g、KH2PO42g10mg、自來水 1000mL，pH 值自然。

葡萄糖（純度99%）、磷酸二氫鉀（分析純）、鄰苯二胺（分析純、）乙二胺四乙酸（分析純）、亞硒酸鹽（純度99%）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；瓊脂（純度96%）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司純度99%）：華中藥業(yè)股份有限公司；甲苯（分析純）、濃硝酸（分析純）：天津市登豐化學(xué)品有限公司；濃硫酸（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TB-214電子分析天平：北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LRH-250-GS生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋、DHG-B50L電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海醫(yī)用核子儀器廠；優(yōu)普UPR系列純水系統(tǒng)：西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；ZWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；UV2600紫外分光光度器：上海精密科學(xué)儀器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津市津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

在試驗(yàn)前將保藏的菌株刮取0.5 cm×0.5 cm接種至平板培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。

1.3.2 液體富硒條件單素優(yōu)化

富硒范圍篩選：精確稱取亞硒酸鈉0.547 6 g純水定容至250 mL，此時(shí)溶液的硒濃度為1.000 0 g/L，按梯度稀釋。設(shè)置硒濃度梯度為 0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00、90.00、100.00 mg/L。根據(jù)羊肚菌的菌絲體生物量及富硒率篩選出羊肚菌的硒生長范圍。

裝液量的篩選：在最適亞硒酸鈉添加量的情況下，250 mL 三角瓶設(shè)置裝液量為 75、100、125、150、175 mL，根據(jù)富硒菌絲生物量與富硒率確定最佳裝液量。

初始pH值篩選：在最優(yōu)條件下，對(duì)羊肚菌富硒液體培養(yǎng)基的初始pH值（用0.1 moL/L的NaOH和0.1 moL/L的HCl調(diào)節(jié)）篩選，設(shè)置初始pH值梯度為5、6、7、8、9，根據(jù)富硒菌絲生物量與富硒率確定最佳初始pH值。

發(fā)酵時(shí)間篩選：在最優(yōu)條件下，設(shè)置發(fā)酵時(shí)間分別為 3、4、5、6、7、8 d，根據(jù)富硒菌絲生物量與富硒率確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.3 液體富硒條件正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）的正交分析試驗(yàn)，以確定各因素對(duì)羊肚菌菌絲生物量及富硒率的影響，確定其條件的最佳組合。正交因素及水平見表1。

表1 正交因素及水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 硒含量的測(cè)定

硒母液配制：精確稱取亞硒酸鈉0.219 0 g，先用10mL鹽酸溶液（HCl∶H2O=1∶1，體積比）潤濕，放入水浴鍋55℃加熱促溶，冷卻后用稀硝酸（HNO3∶H2O=1∶9，體積比）定容至100 mL，此時(shí)得到1 g/L的硒溶液。將其液稀釋100倍得到10 μg/mL的硒溶液，配置濃度為0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1 mL加水至40.0 mL，再分別加入2.0 mL 5%乙二胺四乙酸和2.0 mL 1%鄰苯二胺，用50%HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至2.0，混勻后20℃避光60 min，加入10.0 mL甲苯，超聲4 min后靜置10 min。在335 nm波長下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，硒含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品硒含量的測(cè)定

硒含量測(cè)定原理：鄰苯二胺法[16-17]，精確稱取樣品0.3 g，研磨后放入三角瓶中，用10.0 mL濃硫酸潤濕樣品，加入20.0 mL濃硝酸-高氯酸（2∶1，體積比）混合酸，消化過夜。用水浴加熱至溶液漸漸變?yōu)樽攸S色，白煙除盡為止，加入10.0 mL的稀鹽酸（濃鹽酸∶蒸餾水=1∶9，體積比），繼續(xù)加熱至溶液不變色，即達(dá)到消化終點(diǎn)。取10.0 mL消化液，加純水30.0 mL，再加入5%乙二胺四乙酸2.0 mL和1%鄰苯二胺2.0 mL，因用強(qiáng)酸消化故pH值不用調(diào)節(jié)，混勻后20℃避光放置60 min，加入10.0 mL甲苯，超聲4 min，移入分液漏斗中靜置10 min[18]。在335 nm波長下測(cè)定試液的吸光度，以空白樣做對(duì)比，測(cè)定試液的吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線求出硒濃度，富硒率計(jì)算公式如下所示。

F/%=（Wi-W0）×Mi/Wj×100

式中：F為富硒率，%；Wi為富硒菌絲體硒含量，mg/g；W0為空白（不添加硒）菌絲體硒含量，mg/g；Wj為培養(yǎng)基內(nèi)添加的初始硒量，mg；Mi為富硒菌絲體干重，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

硒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖1所示。菌株的硒含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出或者通過線性回歸方程y=182.99x-22.872（R2=0.998 6）。

圖1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of selenium content

2.2 羊肚菌耐硒范圍及富硒率結(jié)果

最適富硒范圍及最佳富硒率篩選結(jié)果見表2和圖2。

表2 耐硒范圍及富硒率結(jié)果Table 2 Results of selenium tolerance range and selenium enrichment rate

圖2 富硒生物量及富硒率結(jié)果Fig.2 Results of Selenium-rich biomass and selenium enrichment rate

由表2和圖2可看出硒添加量在0～100 mg/L范圍內(nèi)羊肚菌菌絲均能生長，當(dāng)硒添加量在0～20 mg/L范圍內(nèi)菌絲生物量較高且相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)硒添加量超過20 mg/L時(shí)，菌絲生物量逐漸減少。富硒率在0～5 mg/L時(shí)較少，在10 mg/L～20 mg/L逐漸增加，大于20 mg/L時(shí)逐漸減少并且不穩(wěn)定。綜合考量，生物量和富硒率考慮選擇添加量為20 mg/L。

2.3 裝液量篩選結(jié)果

最佳裝液量篩選結(jié)果見表3。

表3 裝液量篩選結(jié)果Table 3 Filling volume screening results

由表3可以看出在75 mL～150 mL范圍內(nèi)隨著裝液量的增加菌絲生物量逐漸增加，在150 mL～175 mL范圍內(nèi)隨著裝液量的增加菌絲生物量逐漸減小。當(dāng)裝液量為125 mL時(shí)，菌絲生物量與富硒率達(dá)到最佳，初步篩選出最佳裝液量為125 mL。

2.4 初始pH值篩選結(jié)果

初始pH篩選結(jié)果見表4。

表4 pH值篩選結(jié)果Table 4 pH value filter result

由表4可知，當(dāng)pH值為5～6時(shí)，菌絲生物量、硒含量及富硒率逐漸增加，且當(dāng)pH值為6時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大（11.072 g/L），富硒率達(dá)到最高（31.30%），硒含量較高（0.804 2 mg/g）。當(dāng)pH值在7～9范圍內(nèi)菌絲生物量、硒含量及富硒率均呈下降趨勢(shì)，所以初步篩選出pH值為6。

2.5 發(fā)酵時(shí)間篩選結(jié)果

發(fā)酵時(shí)間篩選結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵時(shí)間篩選結(jié)果Table 5 Filling volume screening results

由表5可以看出隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌絲在3 d～6 d生長速度較快富硒率快速升高，在6 d以后生長速度較慢且富硒率逐漸降低。故發(fā)酵時(shí)間選6 d較好。

2.6 富硒條件正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental result

正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，由極差|R|值可知硒濃度、裝液量、發(fā)酵時(shí)間及pH值4個(gè)因素對(duì)富硒率影響的大小順序?yàn)锳＞D＞C＞B，即硒濃度＞pH值＞發(fā)酵時(shí)間＞裝液量，正交試驗(yàn)表明能夠使富硒率達(dá)到最大值的最佳組合是A2B2C1D1。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見表7。

表7 方差分析結(jié)果Table 7 Results of variance analysis

如表7所示，4個(gè)影響因素中硒濃度達(dá)到極顯著水平，發(fā)酵時(shí)間和pH值達(dá)到顯著水，裝液量影響不顯著，即對(duì)富硒率影響的大小順序?yàn)锳＞D＞C＞B，其中硒濃度影響最大，與極差結(jié)果基本一致。因此確定羊肚菌最佳液體富硒條件為：硒濃度20 mg/L、裝液量125 mL、發(fā)酵時(shí)間6 d、pH值為6。

驗(yàn)證試驗(yàn)：用正交試驗(yàn)得出的最佳液體培養(yǎng)條件A2B2C1D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)置5組平行試驗(yàn)，得出羊肚菌菌絲生物量達(dá)到11.304 g/L，有機(jī)硒含量為0.683 mg/g，富硒率為37.15%，因此本試驗(yàn)所得的羊肚菌最佳液體富硒條件真實(shí)可靠。張躍飛[19]在富硒羊肚菌的工藝優(yōu)化中得到亞硒酸鈉的添加量為9 mg/L，裝液量為100 mL/250 mL，pH值7.0，富硒率為18.34%。冮潔等[20]在羊肚菌菌絲體富硒過程中得到的最適培養(yǎng)條件為：亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 mg/L，裝液量100 mL/250 mL，溫度25℃，裝液初始pH值7，富硒率最大達(dá)9.10%。丁健峰[21]在羊肚菌富硒深層發(fā)酵工藝及產(chǎn)物功能性研究中硒添加量為86.67 mg/L，培養(yǎng)溫度25.73℃，菌絲生物量的達(dá)到10.339 g/L、富硒率達(dá)到18.6%。本試驗(yàn)在羊肚菌較高生物量的同時(shí)也保持高富硒率，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相比都有顯著提高，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有一定的參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定梯棱羊肚菌最佳液體富硒養(yǎng)條件為：硒濃度20 mg/L、裝液量125 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間6 d、pH值為6，在此條件下羊肚菌菌絲生物量達(dá)到11.304 g/L，有機(jī)硒含量為0.683 mg/g，富硒率為37.15%。

本試驗(yàn)中無機(jī)硒的添加對(duì)羊肚菌的生長在高濃度條件下具有抑制作用，但在較低濃度下生物量及富硒率不斷增加。表明向羊肚菌液體培養(yǎng)基中添加無機(jī)硒來提高富硒率是有效可行的。為了進(jìn)一步提高富硒率，可以進(jìn)從分子角度進(jìn)一步對(duì)羊肚菌富硒機(jī)理進(jìn)行研究，提高硒的轉(zhuǎn)化效率。富硒羊肚菌的研發(fā)具有一定的藥理保健功效，使富硒羊肚菌在食品及保健品方面具有廣闊的發(fā)展及應(yīng)用前景。