董璐，吳玥琨，吳亞敬，張燕

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學醫(yī)學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

蛋白質是生物體內(nèi)最豐富且功能多樣的生物大分子。蛋白質的獨特構象決定了它的功能特性，這種構象可以被體內(nèi)多種化學途徑所干擾，造成蛋白質損傷，從而導致機體病變[1-3]。非酶促糖化，也稱為美拉德反應，是蛋白質損傷的途徑之一[4]。反應過程中活性羰基化合物與蛋白質氨基基團結合，導致機體蛋白質共價損傷，并形成內(nèi)源性晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），這被認為與許多人類疾病的發(fā)病機制相關，如糖尿病及其并發(fā)癥，動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病等[5-10]。根據(jù)流行病學調(diào)查顯示，體內(nèi)AGEs水平升高是1型糖尿病[11]、β細胞損傷[12-15]及外周胰島素抵抗（insulin resistance，IR）[16-17]的重要危險因素，此發(fā)現(xiàn)引起了研究人員追溯AGEs水平升高的根源的興趣。有科學家認為在高度工業(yè)化的現(xiàn)代飲食環(huán)境中富含豐富的AGEs及其前體物質可能解釋此現(xiàn)象[18]。

食物中外源性AGEs主要是由醛類化合物結合胺或酰胺通過美拉德反應形成，但是由于食品基質及美拉德反應的復雜性，導致AGEs前體物較多，與內(nèi)源性AGEs相比，形成的AGEs具有極強的異質性[19]?，F(xiàn)代飲食中充滿了熱處理食物，這些食物有助于增加機體AGEs的攝入[20]。據(jù)估計，人們每天可以通過牛奶和烘焙產(chǎn)品膳食攝入AGEs量為25 mg/d至75 mg/d[21]。已有研究顯示，膳食AGEs攝入量與血漿游離AGEs相關[22]。雖然外源性AGEs和內(nèi)源性AGEs被認為是兩個獨立的來源，但最近觀察到它們可能協(xié)同作用并導致總體糖毒素負擔，這可能增加AGEs對健康的危害影響[20]。Borg等[23]以AIN-93飼料作為低劑量AGEs組，高溫加熱（165℃）烘焙的AIN-93飼料作為高劑量AGEs組，研究膳食攝入AGEs對胰島β細胞損傷的影響，結果表明高劑量膳食攝入AGEs會對胰島β細胞造成損傷。但是由于飼料基質組成復雜，高溫加熱不僅增加AGEs的含量，同時也增加飼料中其它有害物的含量，如糖氧化產(chǎn)物，脂質氧化產(chǎn)物，α-二羰基化合物等，均可在體內(nèi)引起機體AGEs的生成[24]，所以不能完全證明AGEs的作用。Li等[25-26]分別研究野生型大鼠和高脂飲食喂養(yǎng)大鼠暴露于游離態(tài)Nε-羧甲基賴氨酸后對大鼠機體的損傷，結果表明游離態(tài)Nε-羧甲基賴氨酸可對大鼠腎臟造成損傷。但目前還鮮少有關于膳食攝入蛋白質結合態(tài)AGEs對機體損傷的報道，所以填補此研究空白是十分必要的。

本研究以丙酮醛修飾β-乳球蛋白產(chǎn)物（methylglyoxal modified β-lactoglobulin product，MG-bLG）為蛋白質結合態(tài)AGEs的代表物，通過灌胃攝入方式測定AGEs對昆明（KM）小鼠體重、攝食量、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、血脂、血清中AGEs水平及IR相關指標的影響，來研究蛋白質結合態(tài)AGEs對機體IR的促進作用，以期為蛋白質結合態(tài)AGEs誘導機體IR提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Multiskan Sky全波長酶標儀：美國Thermo公司；Accu-Chek羅氏活力血糖儀、Accu-Chek羅氏活力血糖試紙：德國羅氏診斷公司；冷凍離心機Microfuge 20R：美國貝克曼公司。

1.2 實驗動物及飼料

昆明小鼠（KM，雄性、6周齡）：北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXX（京）2016-0006，合格證No.11400700294047，于天津科技大學實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境達到凈化級別。大小鼠維持飼料：斯貝福（北京）生物技術有限公司，組成成分：粗蛋白≥180 g，粗脂肪≥40 g，粗纖維≤50 g，水分≤100 g。

1.3 試驗方法

1.3.1 MG-bLG的制備

配置MG與bLG的反應溶液，使MG和bLG在0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中的終濃度分別達到2 mmol/L和1.8 mg/mL。將反應溶液在100℃下孵育1 h，待反應結束后立即進行超濾以除去未反應的MG。將溶有MG修飾的bLG產(chǎn)物（MG-bLG）的溶液冷凍干燥得到MG-bLG粉末。將MG-bLG重溶于0.9%生理鹽水中，至終濃度為2 mg/mL用于實驗灌胃所用。

1.3.2 動物飼養(yǎng)

在金融全面去杠桿的大政策背景之下，無論是機構信貸還是個人信貸都將面臨收緊。通過對現(xiàn)金貸更嚴格的監(jiān)管，個人杠桿率，尤其是信用較差個人的杠桿率，將有一定程度的降低。通過對現(xiàn)金貸平臺自身杠桿率的控制，現(xiàn)金貸行業(yè)的風險將進一步被抑制。通知規(guī)定，小貸公司通過信貸資產(chǎn)轉讓、ABS方式獲得的資金也要進入杠桿率計算，杜絕了現(xiàn)金貸平臺表外融資，進一步降低了現(xiàn)金貸行業(yè)的整體杠桿率。

雄性6周齡SPF級KM小鼠30只，進行1周適應性喂養(yǎng)，隨機分為2組，空白對照組[C組，體重（36.1±1.3）g]，實驗組[MG-bLG 組，體重（35.8±1.7）g]。C 組每天灌胃與MG-bLG組體積相同的0.9%生理鹽水，MG-bLG組每天灌胃0.2 mL MG-bLG（2 mg/mL，溶于0.9%生理鹽水），連續(xù)灌胃6周。飼養(yǎng)條件：每籠5只小鼠，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝夜交替光照，自由攝食飲水，喂養(yǎng)6周后停止喂養(yǎng)。

1.3.3 血清樣本收集及保存

喂養(yǎng)結束后，小鼠禁食12 h后，眼球取血，全血4℃條件下4 000 r/min離心15 min，分離獲得血清，分裝后于-80℃冰箱保存。

1.3.4 FBG值的測定

動物喂養(yǎng)過程中，每周測定一次小鼠空腹血糖值。測定之前小鼠斷糧12±0.5 h，采用尾靜脈取血方式測定小鼠血糖值作為空腹血糖值。實驗開展前測定1次空腹血糖作為0點空腹血糖值。

1.3.5 FINS水平測定

FINS水平使用小鼠胰島素ELISA試劑盒測定，測定方法按照說明書操作。

1.3.6 血清中血脂含量測定

分別測定血清中LDL-C、HDL-C、T-CHO和TG含量，測定方法按照相應測試盒說明書操作。

1.3.7 IR相關指數(shù)分析

采用homeostasis model assessment（HOMA）穩(wěn)態(tài)模型[27]評價 IR 水平（HMOA-IR）、胰島素敏感性（insulin sensitivity，IS）水平（HOMA-IS）及胰島β細胞功能（HOMA-β）。計算公式如下：

HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

HOMA-IS=22.5/（FBG×FINS）

HOMA-β=20×FINS/（FBG-3.5）

式中：FBG為空腹血糖值，mmol/L；FINS為空腹胰島素值，mU/L；22.5/20/3.5為各公式常量系數(shù)。

1.3.8 血清中AGEs含量

采用ELISA測定小鼠血清中AGEs含量，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結果采用均值±標準差表示。采用SPSS 24進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 MG-bLG對小鼠體重和攝食量的影響

MG-bLG對小鼠體重和攝食量的影響如表1所示。

在灌胃MG-bLG前（0周），MG-bLG組小鼠體重與C組小鼠體重相比，不具有顯著性差異。經(jīng)2周的灌胃干預，MG-bLG組小鼠體重與C組小鼠體重比較出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），灌胃持續(xù)至 6周，MG-bLG組小鼠的體重較于C組分別增加4.03%、4.79%、6.84%、8.55%和9.77%。在實驗過程中，MG-bLG組小鼠的攝食量高于C組，說明MG-bLG組小鼠的體重重于C組小鼠的體重可能是由攝食量的不同而引起。此結果與現(xiàn)有研究結果相一致，AGEs有刺激食欲的功能，可以造成機體營養(yǎng)過剩[28]。

表1 MG-bLG對小鼠體重及攝食量的影響Table 1 The effect of MG-bLG on body weight and food intake in mice

2.2 MG-bLG對小鼠血脂的影響

在2型糖尿病和IR的研究中發(fā)現(xiàn)，個體除了表現(xiàn)為糖代謝異常外，還會發(fā)生脂質代謝紊亂現(xiàn)象[29]。MG-bLG對小鼠血脂的影響如表2所示。

表2 MG-bLG對小鼠血清血脂的影響Table 2 The effect of MG-bLG on serum lipids in mice

由表2可知，經(jīng)長時間攝入MG-bLG，MG-bLG組小鼠 LDL-C、TG、T-CHO 水平分別為 0.31、1.10、2.60 mmol/L，顯著的高于 C 組（P＜0.05），HDL-C 水平無顯著變化。說明長期攝入MG-bLG引起小鼠脂質代謝變化。

2.3 MG-bLG對小鼠血糖的影響

MG-bLG對小鼠血糖的影響如圖1所示。

由圖1可知，MG-bLG組小鼠0～6周FPG平均值分別為 5.2、5.1、6.4、6.8、7.0、7.1、7.1 mmol/L，隨著灌胃時間的延長，F(xiàn)PG值增大。經(jīng)灌胃MG-bLG 3周后，MG-bLG組小鼠的FPG水平顯著高于C組（P＜0.05）。膳食干預4周后，MG-bLG組小鼠FPG值均在7.0mmol/L以上。說明長時間攝入MG-bLG可增高小鼠的FPG水平。

圖1 MG-bLG對小鼠FBG的影響Fig.1 The effect of MG-bLG on FBG in mice

2.4 MG-bLG對小鼠FINS的影響

MG-bLG對小鼠FINS的影響如圖2所示。

圖2 MG-bLG對小鼠FINS的影響Fig.2 The effect of MG-bLG on fasting insulin in mice

經(jīng)灌胃6周MG-bLG后，MG-bLG組小鼠FINS水平為14.8 mU/L，顯著高于（P<0.05）C組小鼠的FINS水平（12.5 mU/L）。血糖濃度升高可刺激胰島β細胞增加胰島素合成及分泌，以維持機體血糖平衡，而MG-bLG組FINS水平顯著高于C組，說明MG-bLG可促進小鼠血糖水平升高，促進機體合成分泌胰島素，從而導致胰島素水平升高。

2.5 IR相關指數(shù)分析

IR相關指數(shù)結果如表3。

表3 IR相關指數(shù)Table 3 Insulin resistance related index

MG-bLG組的HOMA-IR水平為4.86，顯著高于C 組的 3.12（P<0.05），MG-bLG 組的 HOMA-IS指數(shù)為0.21，顯著低于C組的0.28（P<0.05），說明小鼠長時間攝入MG-bLG會增加胰島素抗性，降低胰島素敏感性。MG-bLG組的HOMA-β指數(shù)為84.94%，低于C組的107.79%，但無顯著性差異，說明MG-bLG對小鼠胰島β細胞無顯著性影響。通過上述分析可知，MG-bLG可通過促進IR，從而增大2型糖尿病風險。

2.6 血清中AGEs水平

MG-bLG對小鼠血清中AGEs水平的影響如圖3所示。

圖3 MG-bLG對小鼠血清AGEs水平的影響Fig.3 The effect of MG-bLGon the concen tration of AG Esinmice

由圖3可知，與C組相比，灌胃攝入MG-bLG后，小鼠血清中AGEs水平升高至131.99 pg/mL，是C組AGEs水平（43.88 pg/mL）的 3倍（P<0.05），說明 MG-bLG可以促進小鼠體內(nèi)AGEs的累積，此結果與現(xiàn)有關于胰島抵抗和2型糖尿病模型中的研究結果一致。有研究表明，2型糖尿病患者體內(nèi)AGEs含量高于健康個體[30]。通過HOMA-IR評估發(fā)現(xiàn)AGEs的循環(huán)水平與胰島素抵抗相關，即使在非肥胖的非糖尿病受試者中也是如此[31]。說明MG-bLG的長時間攝入可導致機體內(nèi)AGEs水平升高。

3 結論

MG-bLG攝入導致小鼠體重和攝食量增大，F(xiàn)BG升高，并促進胰島素的合成和分泌增到，進而導致HOMA-IR增大，HOMA-IS減小。此外小鼠血清內(nèi)AGEs水平升高，LDL-C、TG和T-CHO水平升高，說明長時間攝入蛋白質結合態(tài)AGEs可改變機體糖脂代謝，促進機體IR，增加機體患2型糖尿病的風險。因此，應盡量降低飲食中攝入過多的蛋白質結合態(tài)AGEs，以免其誘導機體IR甚至是糖尿病的發(fā)生。