王地均，金香，唐宗湘，王長明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

MrgprD(又名MrgD，TGR7)是具有7個跨膜蛋白的G蛋白偶聯(lián)受體[1-2]。編碼小鼠MrgprD的基因位于第7號染色體[3]，編碼人MrgprD的基因位于第11號染色體[2]。MrgprD主要表達(dá)于外周背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元上，占整個DRG神經(jīng)元數(shù)量的30%[1]。近幾年的研究認(rèn)為β-丙氨酸(β-alanine)是MrgprD特異性激動劑[2-4]，但是只激活50% MrgprD陽性的DRG神經(jīng)元[3]。最初的研究認(rèn)為MrgprD可能參與了疼痛的產(chǎn)生，并認(rèn)為MrgprD陽性的神經(jīng)元占整個植物凝集素B4(IB4，非肽能神經(jīng)元標(biāo)記物)陽性神經(jīng)元的70%[1,3]。MrgprD也參與了癢覺的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸激活MrgprD產(chǎn)生的癢是一種非組胺依賴的癢[4]。也有研究認(rèn)為MrgprD和腫瘤的產(chǎn)生有關(guān)[5]，該受體也是腎素-血管緊張素受體的成員，參與了血管的收縮[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)了MrgprD參與神經(jīng)病理性疼痛的新機(jī)制[7]，過去的研究認(rèn)為MrgprD在痛覺、癢覺和腫瘤產(chǎn)生也有重要作用，因此我們將綜述MrgprD的研究現(xiàn)狀，為我們認(rèn)識MrgprD的功能并為相關(guān)疾病治療提供參考。

1 MrgprD的發(fā)現(xiàn)

2001年Dong發(fā)現(xiàn)外周感覺神經(jīng)元表達(dá)一系列的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，命名為Mrgs，包括MrgA、MrgB、MrgC、MrgprD、MrgE、MrgF、MrgG幾組成員。這些蛋白質(zhì)具有相似的功能，其中一個成員MrgprD又命名為MrgD，特異性表達(dá)于傷害性感覺神經(jīng)元上，主要是非肽能神經(jīng)元(IB4陽性)，并且表達(dá)P2X3[1]。小鼠MrgprD基因位于第7號染色體，含有2個外顯子，全長9 252 bp，mRNA編碼含321個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[1,8]。人MrgprD基因位于第11號染色體上(11q13.3)，含有1個外顯子，全長1 160 bp，mRNA編碼含321個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[1,8]。MrgprD受體是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)依賴c-Ret陽性神經(jīng)元，小鼠MrgprD陽性的神經(jīng)元是TRPV1陰性，但在大鼠卻是部分TRPV1陽性的[8]。研究人員發(fā)現(xiàn)MrgprD受體的特異性激動劑β-丙氨酸可以激活TGR7受體即MrgprD[2]。隨后的研究也證實(shí)了MrgprD的特異性激動劑是β-丙氨酸[3-4,9-12]。但是MrgprD陽性的神經(jīng)元只占DRG神經(jīng)元的30%，β-丙氨酸只能激活MrgprD陽性神經(jīng)元的50%[3]。2005年Zylka等通過EGFP替代了小鼠MrgprD基因，生成了MrgprD基因敲除小鼠[13]，為我們研究MrgprD提供了研究工具。

2 MrgprD的分子生物學(xué)功能

2.1 MrgprD參與疼痛的產(chǎn)生

最初的研究發(fā)現(xiàn)MrgprD表達(dá)于外周傷害性感覺神經(jīng)元上，認(rèn)為MrgprD和疼痛的產(chǎn)生有關(guān)[1]。后期研究揭示了MrgprD分布及表達(dá)特性，MrgprD陽性的神經(jīng)元主要是非肽能神經(jīng)元，占IB4陽性神經(jīng)元的76%，這些神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維都是無髓鞘的神經(jīng)纖維，外周組織主要表達(dá)于皮膚的表皮層[13]。然而MrgprD如何和痛覺產(chǎn)生相關(guān)并不清楚，有研究認(rèn)為MrgprD激活后抑制了KCNQ2/3鉀通道，增加了背根神經(jīng)元(DRG)神經(jīng)元的興奮性[9]。多數(shù)傷害性感受器都是多功能的，能接受多種不同的疼痛刺激，如熱痛覺、機(jī)械性痛覺、冷痛覺等。研究發(fā)現(xiàn)MrgprD基因敲除小鼠在炎性痛模型中表現(xiàn)為對機(jī)械性傷害刺激的感受缺失，但是對冷刺激和熱刺激的感受都無差異[14]。研究者推測，MrgprD基因敲除小鼠在出生后可能會有一些其他蛋白質(zhì)替代MrgprD的功能。因此，研究者把白喉毒素受體(DTR)插入到MrgprD基因的位置，通過注射白喉毒素條件性刪除表達(dá)MrgprD陽性的神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)MrgprD的神經(jīng)纖維可以快速的感受機(jī)械性刺激[15]。在體實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，表達(dá)MrgprD的神經(jīng)纖維能感受捏或夾引起的刺激而不是輕撫引起的感覺，因此這種機(jī)械感覺和情感無關(guān)[16]。因此，一般認(rèn)為MrgprD是一種和機(jī)械性感覺相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。

MrgprD在腸道中表達(dá)，其中腸道巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞表達(dá)MrgprD可能也和內(nèi)臟疼痛有關(guān)[17]。也有研究認(rèn)為5-氧代二十二碳烯酸(5-oxoETE)通過激活腸道MrgprD引起腸預(yù)激綜合征(IBS)誘導(dǎo)的疼痛[18]。局部給予5-氧代二十二碳烯酸誘導(dǎo)小鼠內(nèi)臟疼痛但不會引起組織炎癥，因此認(rèn)為5-oxoETE直接作用于DRG神經(jīng)元。據(jù)此，MrgprD是否直接和內(nèi)臟痛相關(guān)，還是通過巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞釋放炎癥因子引起疼痛尚存在爭議。

神經(jīng)病理性疼痛是一種難于治療嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疼痛[19-21]。TRP通道中多個成員都和神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)[22-23]。多個G蛋白偶聯(lián)受體家族也參與了神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控[24-26]。我們推測G蛋白偶聯(lián)受體MrgprD可能也參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生。為了證實(shí)我們的假設(shè)，在野生型(WT)小鼠和MrgprD敲除小鼠造坐骨神經(jīng)慢性壓迫(CCI)模型，比較2種小鼠機(jī)械痛覺、熱痛覺過敏以及冷痛覺過敏的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未造模組小鼠3種疼痛感覺都無差異，而神經(jīng)病理性疼痛組小鼠機(jī)械痛和冷痛卻有明顯差異[7]。通過qPCR、免疫組化和鈣成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛小鼠MrgprD的基因水平和蛋白水平都表達(dá)增多，功能也增強(qiáng)。研究中我們首次發(fā)現(xiàn)MrgprD和神經(jīng)病理性疼痛的冷痛產(chǎn)生有關(guān)。TRPA1是已知的和冷痛有關(guān)的通道[27-28]。我們推測MrgprD下游通路可能和TRPA1相關(guān)。結(jié)果顯示，92.99% MrgprD陽性的神經(jīng)元表達(dá)TRPA1。鈣成像和電生理結(jié)果顯示，TRPA1阻斷劑HC-030031明顯抑制了β-丙氨酸激活MrgprD引起的鈣內(nèi)流以及內(nèi)向電流。同時TRPA1基因敲除小鼠DRG神經(jīng)元和β-丙氨酸的反應(yīng)也是明顯減少。為了進(jìn)一步證實(shí)MrgprD下游通路是TRPA1，我們在HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染了MrgprD和TRPA1的質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時轉(zhuǎn)染MrgprD和TRPA1的細(xì)胞比僅轉(zhuǎn)染MrgprD細(xì)胞與β-丙氨酸的反應(yīng)明顯增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示β-丙氨酸激活MrgprD引起TRPA1磷酸化，該磷酸化可以被PKA抑制劑抑制。通過上述結(jié)果，我們認(rèn)為MrgprD下游通過PKA-TRPA1途徑參與了神經(jīng)病理性疼痛冷痛的產(chǎn)生(圖1)。過去的研究認(rèn)為β-丙氨酸激活MrgprD引起癢覺行為[4]，我們推測MrgprD激活在神經(jīng)病理性疼痛的病理?xiàng)l件下也可能會引起痛覺行為。通過高清攝像我們發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸激活MrgprD既產(chǎn)生了癢覺(咬足行為)又產(chǎn)生了痛覺(舔腳行為)的行為，但是在神經(jīng)病理性痛模型中，小鼠足底注射β-丙氨酸引起疼痛為主的舔腳行為。MrgprD通過PKA-TRPA1途徑參與神經(jīng)病理性疼痛的研究為我們揭示了神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的新機(jī)制，也為我們認(rèn)識疼痛的產(chǎn)生機(jī)理提供了新的思路，為治療相關(guān)疾病提供了新的作用靶點(diǎn)。

2.2 MrgprD參與癢覺的產(chǎn)生

小鼠體內(nèi)MrgprD陽性神經(jīng)元代表了不表達(dá)TRPV1的C類纖維傷害感受器的主要亞群[13]。Noritaka等通過MrgprDDTA小鼠，用白喉毒素取代了MrgprD等位基因，可以選擇性的刪除MrgprD。他們通過注射組胺、氯奎等8種不同的引起瘙癢的化合物(不包含β-丙氨酸)，但是并沒有發(fā)現(xiàn)這8種瘙癢物質(zhì)可以通過MrgprD引起瘙癢[29]。

健身者喜歡食用β-丙氨酸使肌肉更加強(qiáng)壯，但會引起刺痛和瘙癢等不愉快的感覺。研究認(rèn)為β-丙氨酸特異性激活外周MrgprD神經(jīng)纖維引起瘙癢的行為是一種非組胺依賴的癢，這種癢覺抗組胺藥物的治療是無效的[4]。研究者給予WT小鼠和MrgprD基因敲除小鼠食用含有β-丙氨酸的糖水，發(fā)現(xiàn)WT小鼠產(chǎn)生瘙癢行為而MrgprD基因敲除小鼠沒有瘙癢行為，所以β-丙氨酸特異性作用于MrgprD引起瘙癢。

方酸二丁酯(SADBE)可以引起過敏性接觸性皮炎[30]。在SADBE小鼠瘙癢模型中，MrgprD陽性神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的去極化靜息膜電位和更大的動作電位，鈉電流增加引起的MrgprD陽性神經(jīng)元的興奮性增加，可能會導(dǎo)致接觸性過敏反應(yīng)相關(guān)的自發(fā)性瘙癢行為[31]。

MrgprD在瘙癢中的作用為我們研究神經(jīng)系統(tǒng)中如何感知、編碼和傳輸瘙癢信號提供了研究思路。同時，MrgprD參與非組胺依賴的癢也為我們治療抗組胺藥無效的癢覺提供了新的藥物靶點(diǎn)。

2.3 MrgprD在腫瘤中表達(dá)

雖然多數(shù)研究認(rèn)為MrgprD主要表達(dá)在外周感覺神經(jīng)元，也有研究發(fā)現(xiàn)MrgprD在肺腺癌、低分化鱗狀細(xì)胞癌、高分化鱗狀細(xì)胞癌以及小細(xì)胞癌中都有明顯表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)在小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3中過表達(dá)MrgprD會引起腫瘤形成[5]。在非小細(xì)胞肺癌中，腫瘤組織MrgprD的表達(dá)明顯高于周圍正常組織[32]。MrgprD在肺癌的形成中可能起著重要作用，可能成為非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)記物，也可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的分子靶點(diǎn)。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)其他腫瘤組織中有MrgprD的表達(dá)。MrgprD如何參與了腫瘤的形成以及是否其他腫瘤的形成有關(guān)，有待我們進(jìn)一步的研究。

2.4 MrgprD在血管中表達(dá)

腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)血壓及心血管疾病發(fā)生中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MrgprD可以參與血管緊張素Ⅲ(Ang Ⅲ)的激活引起花生四烯酸的釋放[33]。Alamandine是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2催化產(chǎn)生的新的7肽，可以激活MrgprD誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)生成增多使血管舒張[34-35]。Habiyakare等發(fā)現(xiàn)兔的主動脈MrgprD與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)共表達(dá)，在正常家兔Alamandine與MrgprD結(jié)合增強(qiáng)乙酰膽堿引起的胸主動脈和髂動脈血管舒張功能，但是在動脈粥樣硬化的家兔主動脈卻沒有這種功能，同樣說明MrgprD參與了血管的舒張[36]。血管緊張素Ⅱ型受體(AT2R)和MAS受體是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要保護(hù)組件。Villela等在實(shí)驗(yàn)中使用內(nèi)源性代謝產(chǎn)物Alamandine觀察到與其受體MrgprD的作用[37]。研究者又發(fā)現(xiàn)MrgprD下游通道通過CAMP-PKA途徑發(fā)揮作用[6]。Alamandine和MrgprD級聯(lián)作用的研究為我們認(rèn)識心血管疾病提供了一個重要線索[38]，為心血管疾病治療提供了新的藥物作用靶點(diǎn)。

3 MrgprD與中醫(yī)藥止癢鎮(zhèn)痛

中醫(yī)藥在止癢、鎮(zhèn)痛等方面效果明確，副作用小。研究認(rèn)為川芎(Lamiophlomis rotata)通過激活脊髓胰高血糖素樣肽-1受體有鎮(zhèn)痛作用[39]。雷公藤內(nèi)酯醇通過大麻素受體-2抑制神經(jīng)病理性疼痛以及骨癌痛[40]。這些中藥成分都是作用G蛋白偶聯(lián)受體起鎮(zhèn)痛作用。但是中醫(yī)藥成分復(fù)雜，多數(shù)中藥止癢、鎮(zhèn)痛的分子生物學(xué)機(jī)制目前都不清楚。本文中我們將探討的MrgprD就是一種表達(dá)于外周，和感覺產(chǎn)生相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。

我們過去的研究認(rèn)為，乳香、末藥在治療神經(jīng)病理性疼痛方面通過作用于瞬時感受器電位離子通道(TRP)來減輕機(jī)械疼痛和熱痛。中藥藥對乳香、末藥通過抑制TRPV1的表達(dá)及功能而鎮(zhèn)痛[41]。中藥的作用經(jīng)常是多靶點(diǎn)的，可能通過多個不同的通道或受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛或止癢作用。許多中醫(yī)藥鎮(zhèn)痛、止癢的分子生物學(xué)機(jī)制目前并不清楚，我們初步試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為有些中藥單體成分可能通過作用于MrgprD起鎮(zhèn)痛作用。通過這些通道或受體，我們還可以篩選效果較好的鎮(zhèn)痛、止癢的中藥單體成分，為中醫(yī)藥的推廣和利用鋪平道路。

4 展望

自2001年被發(fā)現(xiàn)，MrgprD功能的研究越來越受到關(guān)注。作為G蛋白偶聯(lián)受體的一名成員，參與痛覺、癢覺的產(chǎn)生，同時又和腫瘤的形成、血管的舒張有關(guān)(圖1)。癢覺及痛覺信號可以激活MrgprD通過PKA-TRPA1途徑傳入中樞最終引起痛覺或癢覺的產(chǎn)生；Alamandine通過MrgprD介導(dǎo)血管的舒張；MrgprD參與了腫瘤的形成。MrgprD在痛覺和癢覺中的作用已經(jīng)得到證實(shí)，但是其調(diào)節(jié)痛、癢的分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。MrgprD調(diào)節(jié)痛、癢的研究為治療痛、癢相關(guān)疾病提供了藥物作用的靶點(diǎn)，為開發(fā)新的止痛和止癢藥物提供了新的思路。雖然目前認(rèn)為β-丙氨酸是MrgprD特異性激動劑，但是只激活MrgprD陽性神經(jīng)元的50%。我們并不清楚其他50%MrgprD陽性神經(jīng)元功能是什么，也沒有找到能夠激活絕大多數(shù)MrgprD陽性神經(jīng)元的特異性激動劑。另外，有研究認(rèn)為MrgprD和血管的舒張有關(guān)，并且下游通過Camp-PKA途徑參與了血管的舒張，但是否還有其他內(nèi)源性物質(zhì)可以激活MrgprD以及如何通過MrgprD和血管舒張有關(guān)，以及以后如何開發(fā)相關(guān)藥物，治療心血管疾病仍需很長的路要走。也有研究認(rèn)為MrgprD參與了腫瘤的形成，但是MrgprD是如何參與腫瘤的產(chǎn)生的，以及具體的機(jī)制并不清楚。這些腫瘤相關(guān)的研究使MrgprD可能成為抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)。MrgprD作用機(jī)制的研究為痛、癢的產(chǎn)生機(jī)制，腫瘤的發(fā)生，血管的舒張?zhí)峁┝酥匾乃悸泛途€索，為藥物的研發(fā)提供了新的作用靶點(diǎn)。隨著我們對這種G蛋白偶聯(lián)受體研究的深入，MrgprD作用的分子生物學(xué)機(jī)制將逐漸被我們認(rèn)識。

此外，中醫(yī)藥在止癢、鎮(zhèn)痛方面效果明確、副作用小，但是其分子生物學(xué)機(jī)制并不清楚。目前的研究中我們以MrgprD為靶點(diǎn)，探索中醫(yī)藥止癢、鎮(zhèn)痛的分子生物學(xué)機(jī)制，同時還可以篩選中藥的止癢、鎮(zhèn)痛或抗腫瘤的成分，期望能為中醫(yī)藥的推廣和傳播做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。