岳勤霏，陳葉青，范欣生

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限為特征的臨床常見疾病，通常由香煙煙霧等有害顆粒和氣體暴露引起的氣道和(或)肺泡異常導(dǎo)致[1]，其機(jī)制主要與氣道和肺慢性炎癥、氧化應(yīng)激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2]。由于患病人數(shù)多，死亡率高，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。在我國(guó)，COPD是嚴(yán)重危害人民身體健康的重要慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]。

金水六君煎出自《景岳全書》，滋陰而不留邪，化痰而不傷陰，是養(yǎng)陰化痰的代表方劑。現(xiàn)代研究表明，金水六君煎能有效緩解COPD患者的臨床癥狀，改善肺功能，提高患者運(yùn)動(dòng)耐力及生活質(zhì)量[3]，也可減輕COPD患者咳嗽嚴(yán)重程度、頻率、咯痰量，改善喘息癥狀[4]，是中醫(yī)治療COPD的有效方劑，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理的技術(shù)和方法，構(gòu)建金水六君煎治療COPD的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析該方多成分-多靶點(diǎn)間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系，預(yù)測(cè)其防治COPD的潛在靶標(biāo)和作用機(jī)制，為臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 金水六君煎方源

金水六君煎出自《景岳全書·新方八陣》：“治肺腎虛寒，水泛為痰，或年邁陰虛，血?dú)獠蛔?，外受風(fēng)寒，咳嗽嘔惡，多痰喘急等證”[5]，由熟地、當(dāng)歸、陳皮、半夏、茯苓、炙甘草、生姜組成。

1.2 金水六君煎的化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)挖掘

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)獲取金水六君煎中各個(gè)中藥的化學(xué)成分以及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3 COPD相關(guān)靶點(diǎn)挖掘

以“Chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中搜索獲得COPD相關(guān)靶點(diǎn)。以“Chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)中搜索，選取Inference Score排序前200個(gè)基因收入COPD相關(guān)靶點(diǎn)中。

1.4 金水六君煎與COPD交集靶點(diǎn)及功效成分篩選

將在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的藥物成分靶點(diǎn)與在TTD、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以及CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的COPD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)應(yīng)，獲得金水六君煎與COPD交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，規(guī)范為人源(Homo sapiens)的標(biāo)準(zhǔn)基因，作為靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化名稱。

根據(jù)交集靶點(diǎn)結(jié)果，篩選交集靶點(diǎn)與藥物成分中對(duì)應(yīng)的功效成分。

1.5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

根據(jù)上述金水六君煎與COPD交集靶點(diǎn)、功效成分篩選結(jié)果，在Excel表格中建立彼此對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.7.2自帶工具cytoHubba插件對(duì)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行基本網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，選取自由度(Degree)，介數(shù)(Betweenness)和中心性(Closeness)都大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 GO富集分析和KEGG富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入OmicShare開放平臺(tái)(http://omicsmart.com/)，進(jìn)行GO富集分析以及KEGG富集分析。

2 結(jié)果

2.1 金水六君煎的化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)挖掘

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得地黃成分76個(gè)，靶點(diǎn)153個(gè)；當(dāng)歸成分125個(gè)，靶點(diǎn)191個(gè)；陳皮成分63個(gè)，靶點(diǎn)150個(gè)；半夏成分116個(gè)，靶點(diǎn)396個(gè)；茯苓成分34個(gè)，靶點(diǎn)60個(gè)；甘草成分280個(gè)，靶點(diǎn)305個(gè)；生姜成分265個(gè)，靶點(diǎn)683個(gè)。去重以后共獲得金水六君煎藥物成分870個(gè)，靶點(diǎn)982個(gè)。

2.2 COPD相關(guān)靶點(diǎn)挖掘

通過TTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得COPD相關(guān)靶點(diǎn)65個(gè)；通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲得COPD相關(guān)靶點(diǎn)13個(gè)；通過GeneCards獲得COPD相關(guān)靶點(diǎn)6 060個(gè)；通過CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得COPD相關(guān)靶點(diǎn)200個(gè)。去重以后共獲得COPD相關(guān)靶點(diǎn)6 141個(gè)。

2.3 金水六君煎與COPD交集靶點(diǎn)及功效成分篩選

將藥物成分靶點(diǎn)與COPD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)應(yīng)，獲得96個(gè)交集靶點(diǎn)，其中單味藥特有靶點(diǎn)有47個(gè)，2味藥共有靶點(diǎn)有14個(gè)，3味藥共有靶點(diǎn)有13個(gè)，4味藥共有靶點(diǎn)6個(gè)，5味藥共有靶點(diǎn)有5個(gè)，6味藥共有靶點(diǎn)有6個(gè)，7味藥共有靶點(diǎn)有5個(gè)，如表1所示。對(duì)得到的96個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其主要可分為以下7類：①與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)；②與氣道重塑相關(guān)靶點(diǎn)；③與氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)；④與蛋白酶/抗蛋白酶失衡相關(guān)靶點(diǎn)；⑤與氣道平滑肌收縮與氣道黏液高分泌相關(guān)靶點(diǎn)；⑥與激素調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)；⑦與代謝相關(guān)靶點(diǎn)。

根據(jù)金水六君煎與COPD交集靶點(diǎn)篩選結(jié)果，從獲得的藥物成分中篩選金水六君煎的功效成分共435個(gè)，列出其中涉及靶點(diǎn)數(shù)量頻次排列前20的成分如表2所示。

表1 金水六君煎與COPD交集靶點(diǎn)

表2 金水六君煎治療COPD部分功效成分

2.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件將篩選出來的435個(gè)功效成分與96個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中2 230條邊，直觀地呈現(xiàn)了435個(gè)化合物、96個(gè)靶點(diǎn)間的相互作用，如圖1所示。通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過平均值的靶點(diǎn)有20個(gè)，見表3。對(duì)這20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：①與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)有TNF、NR3C1、STAT3、CRP、AHR；②與氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)有：HMOX1、MPO、CAT、SIRT1；③與蛋白酶/抗蛋白酶失衡相關(guān)靶點(diǎn)為α1-AT；④與氣道重塑和氣道黏液高分泌相關(guān)靶點(diǎn)有：MAPK3、MAPK8、EGFR、MAPK1、VEGFA、PPAR-γ；⑤與激素調(diào)節(jié)和代謝相關(guān)靶點(diǎn)有：LPL、GCG、INS。推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是金水六君煎治療COPD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表3 金水六君煎中自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過平均值的靶點(diǎn)信息

2.5 GO富集分析

利用OmicShare開放平臺(tái)對(duì)金水六君煎與COPD的96個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，確定了1 409個(gè)GO條目(P<0.01,FDR<0.01)。其中生物過程相關(guān)條目1 246個(gè)，富集最顯著的為對(duì)生物和化學(xué)刺激的反應(yīng)、多種細(xì)胞生物過程、細(xì)胞增殖、免疫、代謝、運(yùn)動(dòng)、行為、排毒、生物調(diào)節(jié)等。分子功能相關(guān)條目97個(gè)，富集最顯著的為催化活性、抗氧化活性、分子換能器活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等。細(xì)胞組成相關(guān)條目66個(gè)，富集最顯著的為細(xì)胞外區(qū)域部分、膜封閉腔、細(xì)胞器部分、細(xì)胞連接、突觸等，如圖2所示。

2.6 KEGG富集分析

利用OmicShare開放平臺(tái)對(duì)金水六君煎與COPD的96個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析得到62條結(jié)果(P<0.01，F(xiàn)DR<0.01)，其中有17條通路在COPD治療中發(fā)揮重要作用：①與炎癥與免疫相關(guān)通路有10條，包括白細(xì)胞介素17(IL-17)信號(hào)通路、IgE高親和力受體(FcεRI)信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、TNF信號(hào)通路和cAMP信號(hào)通路；②與氧化應(yīng)激與炎癥相關(guān)通路有3條，包括缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O(FoxO)信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路；③與蛋白酶/抗蛋白酶失衡相關(guān)的通路有1條，為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)通路；④與氣道重塑與氣道黏液高分泌相關(guān)的通路有4條，包括MAPK信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體(ErbB)信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路；⑤與細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡相關(guān)的通路有1條，為細(xì)胞凋亡。根據(jù)P值列出17條富集通路，如圖3所示。

3 討論

金水六君煎治療COPD成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，方中藥物含有大量成分，且成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，或多個(gè)成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)出中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。同時(shí)，靶點(diǎn)可能來自于單味中藥，也可能來自于多味中藥，體現(xiàn)了中藥復(fù)方既有單味藥的獨(dú)有貢獻(xiàn)，也有多味藥協(xié)同作用的特點(diǎn)。

金水六君煎作用于96個(gè)與抗炎、抗氧化、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氣道重塑、氣道平滑肌收縮與氣道黏液高分泌、激素調(diào)節(jié)以及代謝相關(guān)的靶點(diǎn)，推測(cè)MAPK3、TNF、PPAR-γ、LPL、HMOX1、MAPK8、NR3C1、MPO、CAT、SIRT1、MAPK1、STAT3、GAPDH、GCG、CRP、AHR、α1-AT、INS、VEGFA、EGFR為治療COPD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，與抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡、改善氣道重塑與氣道黏液高分泌以及激素調(diào)節(jié)與代謝相關(guān)。GO富集分析顯示，金水六君煎能介導(dǎo)對(duì)生物和化學(xué)刺激的反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性等。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，金水六君煎通過與抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡、細(xì)胞凋亡以及改善氣道重塑與氣道黏液高分泌相關(guān)通路治療COPD。

金水六君煎化學(xué)成分如異鼠李素(Isorhamnetin)、異甘草素(Isoliquiritigenin)、異甘草黃酮醇(Isolicoflavonol)、脹果香豆素甲(Inflacoumarin A)等，作用于TNF、NR3C1、STAT3、CRP、AHR等靶點(diǎn)，通過IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等多條通路發(fā)揮抗炎作用。山奈酚(Kaempferol)、甘草酸(Glycyrrhizin)、刺芒柄花素(Formononetin)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(Methylbutenol)等成分作用于HMOX1、MPO、CAT、SIRT1等靶點(diǎn)，通過HIF-1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等多條通路發(fā)揮抗氧化損傷作用；柚皮苷(Naringenin)、川陳皮素(Nobiletin)、槲皮素(Quercetin)、熊果酸(Ursolic acid)等成分作用于α1-AT、MAPK3、MAPK8、EGFR、MAPK1、VEGFA、PPAR-γ等靶點(diǎn)，通過MAPK信號(hào)通路、EGFR信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等多條通路，抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡，改善COPD氣道重塑與氣道黏液高分泌。

氣道和肺部炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化和抗氧化失衡是COPD的主要發(fā)病機(jī)制[2]。研究表明，COPD患者肺組織和外周血中Th17細(xì)胞比例和IL-17A表達(dá)顯著升高[6]，血液和氣道中炎癥細(xì)胞因子TNF-α水平升高[7-8]，血清中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶水平升高，α1-AT水平降低，蛋白酶/抗蛋白酶失衡[9]。香煙煙霧刺激誘導(dǎo)的COPD模型小鼠，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而激活核因子E-2-相關(guān)因子(Nrf2)核轉(zhuǎn)錄，抑制其靶基因HMOX1表達(dá)[10]。調(diào)節(jié)SIRT1/FOXO3a通路，抑制HIF-1α的表達(dá)與釋放，可改善COPD炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)[11-12]。異鼠李素可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。異甘草素可通過減輕炎癥和氧化應(yīng)激，抑制香煙誘導(dǎo)的COPD[14]。山奈酚是黃酮類化合物，具有抗氧化和抗炎活性，對(duì)COPD有治療作用[15-16]。

氣道重塑與氣道黏液高分泌是COPD的主要病理特征[17]，以氣道壁組織結(jié)構(gòu)改變、管腔狹窄、氣流受限等為主要表現(xiàn)[18]。研究表明，MAPK活化與COPD氣道重塑相關(guān)[19]。降低COPD大鼠VEGFA表達(dá)水平，可抑制氣道重塑從而改善COPD[18]。PPAR-γ的激活可抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與COPD患者黏液高分泌調(diào)控[20-21]。柚皮苷可通過改善肺功能，減少炎細(xì)胞，降低白細(xì)胞介素-8(IL-8)，TNF-α水平來治療COPD[22]，對(duì)氣道重塑有保護(hù)作用[23]。槲皮素可降低肺泡灌洗液和肺組織中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子水平，抑制香煙煙霧引起的氣道重塑[24]。

綜上所述，部分印證了本研究的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果，據(jù)此推測(cè)，金水六君煎治療COPD的作用機(jī)制主要與抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及改善氣道重塑和氣道黏液高分泌相關(guān)。

4 結(jié)論

金水六君煎通過435個(gè)功效成分作用于96個(gè)靶點(diǎn)，17條信號(hào)通路，主要通過抗炎、抗氧化、抑制蛋白酶/抗蛋白酶失衡、改善氣道重塑和氣道黏液高分泌，多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用來治療COPD，為深入探討金水六君煎治療COPD的效應(yīng)機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。