李莉　蔣桂芝

摘 要 采用Koch法則對(duì)西番蓮病果樣品進(jìn)行病原菌的分離和致病性測(cè)試，并采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定病原菌。結(jié)果表明，分離得到的編號(hào)為XFL20190803的病原菌為西番蓮果腐病的致病菌;對(duì)其進(jìn)行的形態(tài)特征觀察及菌絲ITS1/ITS4序列在NCBI上的同源性比較結(jié)果表明，XFL20190803為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。

關(guān)鍵詞 西番蓮;果腐病;煙草疫霉菌

中圖分類號(hào)：S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.05.014

西番蓮（Passiflmne hdissims）又名百香果、雞蛋果、熱情果，原產(chǎn)于南美，是多年生熱帶、亞熱帶水果，其香氣濃郁，營養(yǎng)豐富，是一種高級(jí)的天然飲料，被譽(yù)為天然水果之王，深受消費(fèi)者的喜愛。我國在廣西、廣東、海南、福建等地已有大量種植，近些年在云南省的種植面積大幅上升。2019年8月3日，在德宏州芒市遮放鎮(zhèn)的西番蓮種植地（24°11′30″N，98°11′2″E）觀察到西番蓮發(fā)生嚴(yán)重的果腐病，感病果濕腐，病斑邊緣水漬狀，病斑深入果肉，造成大量落果，發(fā)病率達(dá)到56%以上。為使西番蓮果腐病得到有效控制，筆者將感病果帶回實(shí)驗(yàn)室，對(duì)西番蓮果腐病的病原菌進(jìn)行研究，為廣大種植戶提供防治依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

分離材料：感病西番蓮采集于云南省德宏州遮放鎮(zhèn)西番蓮種植園;玉米培養(yǎng)基：玉米粉300 g、瓊脂20 g、水1 000 mL;瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂17 g，水1 000 mL;皮氏培養(yǎng)液：Ca（NO3）2 0.40 g，KH2PO4 0.15 g，Mg（NO3）2 0.15 g，CaCl2 0.06 g，蒸餾水1 000 mL;致病接種果：來源于云南省熱帶作物科學(xué)研究所。

真菌菌絲DNA快速抽提試劑盒、ITS1/ITS4和PCR擴(kuò)增等引物由生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.2 方法

參照Koch法則[1]。

1.2.1 病原的分離培養(yǎng)

將病果用自來水清洗，表面用75%酒精消毒2次，用滅菌刀削去病斑表層皮，把斑病健交界組織切成大小4 mm×4 mm左右的方塊，把組織片置于玉米培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下培養(yǎng)。3～4 d后出現(xiàn)一些菌落，用滅菌針挑取少量菌絲移接到玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，選取具有代表性的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行單菌絲分離、純化培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌種用于致病性測(cè)試。

1.2.2 致病性測(cè)試

采用無傷接種。將無病蟲害、未成熟西番蓮果用自來水清洗，晾干表面的水分后待用;培養(yǎng)5 d的待測(cè)試菌種用接種針劃成約5 mm×5 mm的菌塊備用;將備好的測(cè)試菌塊有菌絲的一面分別貼到準(zhǔn)備好的西番蓮果上，每個(gè)果接種1菌塊，對(duì)照組接種同樣大小的無菌玉米培養(yǎng)基塊。接種果放入保濕缸內(nèi)，在25～28 ℃室溫下保濕培養(yǎng)，3～4 d后取出觀察接種感病情況。接種果致病后，隨即進(jìn)行病原再分離，若分離得到與測(cè)試菌種一致，即可確認(rèn)為致病菌。

1.2.3 病原鑒定

根據(jù)菌落和孢子囊的形態(tài)特征，參照《疫霉菌及其研究技術(shù)》[2]進(jìn)行鑒定。

1.2.3.1形態(tài)鑒定

1）菌落形態(tài)：將純培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)接到新玉米培養(yǎng)基上，在26 ℃室溫、自然光照條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落的生長情況、菌絲寬度等。2）孢子囊形成：將凹面玻片用75%的酒精表面消毒，晾干備用;用滅菌針挑取大小約2.5 mm×2.5 mm的菌塊置于玻片的凹面中，在凹面中加入約3 mL的皮氏培養(yǎng)液，將載有菌塊的玻片放于直徑9 cm培養(yǎng)皿中，再將培養(yǎng)皿置于25～28 ℃、自然光照下的培養(yǎng)缸中保濕培養(yǎng)24～48 h，觀察孢子囊的形成及形態(tài)特征。3）厚垣孢子形成：將在玉米培養(yǎng)基上接種病原菌的培養(yǎng)皿置于26 ℃、空氣濕度（RH）65%的室內(nèi)、自然光照下培養(yǎng)10～15 d，觀察厚垣孢子的形成及形態(tài)。

1.2.3.2分子生物學(xué)鑒定

從菌絲體中提取DNA測(cè)序，利用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增、測(cè)序[3]，使用TIANGEN生化科技有限公司植物基因組試劑盒（DP320-02）進(jìn)行真菌DNA提取，提取方法參照其說明。rDNA ITS區(qū)序列擴(kuò)增及分析采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1（5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），擴(kuò)增該病菌5.8S rDNA及其兩邊的ITS1和ITS4基因片段。

擴(kuò)增反應(yīng)體系為：真菌DNA模板0.5～1.0 μL，ITS1（10 μm）1μL，ITS4（10 μm）1 μL，2×Master Mix12.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠回收，純化后的PCR產(chǎn)物克隆至Pgem-T-easy載體，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。將該病菌的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源性比較，通過MEGA7軟件構(gòu)建病原菌與近源物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析和確定其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離

從12個(gè)病果上分離病原，每個(gè)病果取樣3個(gè)，36個(gè)樣品在玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后得到29個(gè)菌落，7個(gè)為真菌、細(xì)菌混合，得菌率80.5%。用滅菌針分別挑取少量菌絲移接到玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d得到的29個(gè)菌落，經(jīng)鏡檢為1種真菌。選取具有代表性的優(yōu)勢(shì)菌落在瓊脂平板上培養(yǎng)3 d，進(jìn)行單菌絲分離，得到純培養(yǎng)菌種，編號(hào)為XFL20190803，將XFL20190803在PDA上培養(yǎng)5 d，用于致病性測(cè)試。

2.2 致病性測(cè)試

將培養(yǎng)好的菌種打成直徑為5 mm的菌塊接種在備好的西番蓮果上，接種3 d后，接種菌塊表現(xiàn)出與田間一致的感病癥狀，對(duì)照組不感病。對(duì)出現(xiàn)癥狀的感病果進(jìn)行病原再分離，得到與接種測(cè)試菌種一致，確認(rèn)XFL20190803為西番蓮果腐病的致病菌。

2.3 病原鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

2.3.1.1菌落形態(tài)

在玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌落白色，氣生菌絲生長旺盛，粗細(xì)不勻，寬5～10 μm。菌絲膨大，孢囊梗不規(guī)則分枝。

2.3.1.2孢子囊形成

在皮氏液培養(yǎng)36 h，形成大量的孢子囊，孢子囊卵圓形至近圓形，少數(shù)橢圓形，大?。?3～60）μm×（19～50）μm，部分孢子上有絲狀附屬物。孢子囊具乳突，通常1個(gè)，少數(shù)2個(gè)，乳突大多明顯，半球形。孢子囊頂生，常不對(duì)稱，具脫落性，孢囊柄短，0.5～4.8 μm。排孢孔寬4.5～8.0 μm。

2.3.1.3厚垣孢子形成

菌落在玉米培養(yǎng)基上置于26 ℃、65%RH室內(nèi)、室內(nèi)自然光照下培養(yǎng)10 d，有厚垣孢子形成。厚垣孢子頂生或間生，近球形，直徑20～38 μm。

根據(jù)菌落形態(tài)和孢子囊、厚垣孢子的形態(tài)特征，鑒定為煙草疫霉菌。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS1/ITS4引物提取、擴(kuò)增菌株DNA的ITS片段，獲得837 bp、668 bp 2個(gè)ITS序列（登錄號(hào)為MN922945、MN945401），在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較，通過BLAST搜索核酸數(shù)據(jù)庫顯示，MN922945與已報(bào)道Phytophthora nicotianae的ITS 序列中KT148947、MH341621相似度為99.28%和100%。通過MEGA7軟件構(gòu)建病原菌XFL20190803 ITS系列與近源物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示病原菌XFL20190803與P. nicotianae的菌株CNRnico8RE和CNRnico62RC位于同一分枝，支持率為100%。

病原菌XFL20190803的形態(tài)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致，確定病原菌為P. nicotianae。

3 小結(jié)與討論

煙草疫霉（P. nicotianae）異名寄生疫霉菌（P. parasitica），寄主廣泛，我國已報(bào)道的寄主有番木瓜、番荔枝、菠蘿、陽桃、番木瓜、柚、柑桔、西番蓮、番石榴等熱帶果樹和草莓、煙草、黃瓜、蕃茄等[4]，以及文殊蘭、康乃馨等多種花卉共50多種，在臺(tái)灣種植區(qū)也分離到此病原菌[5]。在廣東種植區(qū)，有煙草疫霉侵染西番蓮幼苗的報(bào)道，在成齡株中很少發(fā)生，其侵染部位多見于葉片、莖蔓、果實(shí)中，少見于莖基部[6];在福建種植區(qū)也有西番蓮疫病發(fā)生，輕者引起落葉落果，重則引起整株或大面積死亡，其病原菌經(jīng)鑒定為煙草疫霉[7]。有報(bào)道西番蓮果腐病由灰霉菌和菌核菌引起[4]。本研究證實(shí)在德宏州引起西蕃蓮果腐病的是煙草疫霉，與廣東省、福建省報(bào)道的一致，說明煙草疫霉在我國分布廣泛，對(duì)西番蓮的為害沒有地域間差異。西番蓮果腐病多發(fā)生于氣溫、濕度相對(duì)較高的雨季，病原菌煙草疫霉主要以游動(dòng)孢子或孢子囊借助風(fēng)雨或流水傳播而暴發(fā)流行，高溫高濕是其發(fā)生流行的主要環(huán)境因素。煙草疫霉是導(dǎo)致西番蓮果腐的主要致病菌，該病菌也可造成大面積植株死亡，因此要控制西番蓮果腐病的發(fā)生，應(yīng)選擇在通風(fēng)良好、土層深厚的緩坡地建園，同時(shí)在種植管理上采取相應(yīng)的措施：1）種植抗病品種，如相對(duì)抗病品種黃果西番蓮;2）加固種植園中的棚架，減少風(fēng)吹動(dòng)對(duì)枝蔓、果實(shí)造成傷口;3）及時(shí)摘除病果，剪除染病枝葉和病死植株，并集中燒毀;4）在雨季做好田間管理，加強(qiáng)通風(fēng)、土壤排水，多施有機(jī)肥、微生物菌肥，使根系生長旺盛，提高植株抗病性;5）及時(shí)控制害蟲的為害，減少害蟲對(duì)果實(shí)、枝蔓造成傷口;6）發(fā)病初期用甲霜靈、霜霉凈、甲霜·錳鋅等對(duì)病原菌有效的殺菌劑進(jìn)行噴霧防治，每隔7～10 d噴施，連續(xù)噴2～3次，同時(shí)幾種藥劑交換使用，避免病菌產(chǎn)生抗藥性。

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[7] 西蕃蓮病害研究課題組.西蕃蓮疫病的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，1993，13（1）：75-78.

（責(zé)任編輯：劉昀）

收稿日期：2020-01-16

作者簡(jiǎn)介：李莉（1972—），女，湖南祁東人，本科，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)闊釒ё魑镌耘嗉夹g(shù)推廣。

※為通信作者，E-mail： 316606049@qq.com。