歐陽(yáng)嶷，閻雪晶，劉 穎，張 婧

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）是一種危及生命的腦血管病急重癥，約有80%的SAH是由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranial aneurysm,IA）破裂造成的，女性罹患SAH和IA的比率約為男性的1.6倍[1-2]。近來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）證實(shí)染色體9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區(qū)域與歐洲、日本人群的多種血管疾病相關(guān)[3-5]，但迄今為止CDKN2A-CDKN2B區(qū)域基因多態(tài)性與漢族人群IA是否存在關(guān)聯(lián)僅有少數(shù)報(bào)道[6]，尚無(wú)定論。

本研究以中國(guó)漢族IA病例作為研究對(duì)象，通過(guò)病例對(duì)照的關(guān)聯(lián)分析方法，研究CDKN2ACDKN2B區(qū)域的基因多態(tài)性與漢族人群IA的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，采用分層分析的方法，從遺傳學(xué)角度探討存在于IA患者的性別差異與上述基因多態(tài)性是否存在關(guān)聯(lián)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)：IA組：選取近十年由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和神經(jīng)外科門診、急診及病房確診的IA患者500 例，入選病例均為漢族。所有患者均經(jīng)數(shù)字血管減影造影（DSA）和/或頭部三維CT血管造影（3D-CTA）和/或頭部核磁血管造影（MRA）或手術(shù)證實(shí)存在IA（指囊性動(dòng)脈瘤）。

對(duì)照組：同時(shí)期500 名健康志愿者，均為漢族，無(wú)血緣關(guān)系，年齡和性別與IA組相匹配，無(wú)心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、肝腎疾病、腫瘤、感染以及自身免疫性疾病等。所有對(duì)照組成員經(jīng)神經(jīng)影像學(xué)（MRA或3D-CTA）證實(shí)無(wú)IA。

研究經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)，所有受試者均簽署知情同意書。年齡未滿18 歲或存在重度功能殘疾者（如意識(shí)障礙、嚴(yán)重肢體功能障礙等）均需征得法定監(jiān)護(hù)人同意并簽字。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：有下列情況之一者，予以排除：各種血液系統(tǒng)疾病或有出血傾向者（血小板計(jì)數(shù)＜100 ×109/L）；有嚴(yán)重的肝腎疾病、腫瘤、感染、自身免疫性疾病等；存在多囊腎、Ehlers Danlos綜合癥、Marfan綜合癥、Moyamoya病、肌纖維發(fā)育不良及鐮狀細(xì)胞病者；經(jīng)神經(jīng)影像學(xué)證實(shí)的梭形動(dòng)脈瘤或顱內(nèi)動(dòng)脈夾層者或動(dòng)靜脈畸形者；未取得患者或法定監(jiān)護(hù)人知情同意者。

1.2 受試者臨床資料采集 記錄研究對(duì)象的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、家族史、既往史、用藥史等。記錄研究對(duì)象的高血壓病史。根據(jù)神經(jīng)影像學(xué)資料（DSA、3D-CTA或MRA）記錄IA組IA的數(shù)量（單發(fā)IA和多發(fā)IA），并記錄IA組中單發(fā)IA者的IA部位（前循環(huán)、后循環(huán)及其它）。在記錄上述臨床資料的基礎(chǔ)上，再按性別分別記錄和統(tǒng)計(jì)。

1.3 研究位點(diǎn)選擇 參閱文獻(xiàn)，查找美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/），根據(jù)Iternational HapMaP Project數(shù)據(jù)庫(kù)中CHB的基因組遺傳變異資料確定基因各SNP分布頻率。利用HaploView軟件中的Tag algorithm篩選標(biāo)簽SNP（Tag SNPs）。優(yōu)先選取位于蛋白編碼區(qū)可導(dǎo)致氨基酸序列改變、5'或3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)等具有潛在功能學(xué)意義的位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區(qū)域4 個(gè)與血管疾病相關(guān)的SNP（rs1333040、rs2891168、rs2383207和rs10757278）作為研究位點(diǎn)。

1.4 基因多態(tài)性檢測(cè) IA組和對(duì)照組每個(gè)受試者采集2～3 mL靜脈血，EDTA抗凝，應(yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。將提取的人基因組DNA用紫外分光光度儀進(jìn)行純度鑒定和定量分析。對(duì)所有研究對(duì)象的DNA應(yīng)用TaqMan SNP基因分型檢測(cè)技術(shù)（ABI 7900）檢測(cè)上述位點(diǎn)的基因型。設(shè)計(jì)并合成本實(shí)驗(yàn)所需的TaqMan探針，探針引物序列見(jiàn)表1。

表1 各SNP探針引物序列Tab.1 Primer sequences of SNP probes

PCR反應(yīng)體系為：人基因組DNA 20 ng（1 μL），上下游引物各0.5 μL，probe-FAM和probe-VIC各0.2 μL，Taqman Genotyping Master Mix 10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。采用PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，以60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 獲得樣本個(gè)體基因型后，將所有結(jié)果數(shù)字化錄入數(shù)據(jù)庫(kù)，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件包SPSS 13.0進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)?；蛐秃偷任换蝾l率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

應(yīng)用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)分析IA組和對(duì)照組基因型頻率分布是否符合H-W平衡。假定p代表雙態(tài)遺傳標(biāo)記的一個(gè)等位基因頻率，q代表另一個(gè)等位基因頻率，在一個(gè)隨機(jī)婚配群體中，基因型頻率分布應(yīng)符合二項(xiàng)式分布：即(p+q)2＝p2＋2pq＋q2＝1。采用公式(1－Ho/He)2×n，Ho為觀察到的雜合子基因型頻率，He為期望值（He＝2pq），n為受檢個(gè)體數(shù)目，df＝1，如P＞0.05，則說(shuō)明樣本符合H-W平衡。應(yīng)用SPSS 13.0軟件包Logistic回歸模型中的二分類反應(yīng)變量的Logistic回歸校正IA的危險(xiǎn)因素（高血壓、吸煙及飲酒過(guò)量）及年齡的影響，探討基因型與漢族IA人群的相關(guān)性。利用多變量Logistic回歸分析研究上述臨床資料各分層（IA的數(shù)量分層及位分層）中CDKN2A-CDKN2B區(qū)域變異的頻率與對(duì)照組的差別。為評(píng)估性別差異性效應(yīng)，將男性和女性的數(shù)據(jù)分別統(tǒng)計(jì)分析，并且在校正傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的基礎(chǔ)上，在回歸模型中引入基因型*性別交互變量（interaction variable）進(jìn)一步證實(shí)性別差異與基因型的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床資料匯總 研究表明，與對(duì)照組相比，高血壓、大量飲酒與IA的發(fā)生相關(guān)（P＜0.05），是IA發(fā)生的危險(xiǎn)因素（表2）。

表2 研究對(duì)象臨床資料一覽表Tab.2 List of clinical data of the subjects

2.2 所檢各SNP分型圖及基因型檢測(cè)結(jié)果 對(duì)IA組和對(duì)照組每個(gè)SNP基因型應(yīng)用χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示上述兩組各SNP位點(diǎn)基因型頻率分布沒(méi)有偏離Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。說(shuō)明本研究選取的樣本具有人群代表性，適合做遺傳學(xué)分析。

各SNP分型圖及基因型檢測(cè)結(jié)果如圖1（見(jiàn)封二）所示。

在rs1333040位點(diǎn)上，基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：IA組T/T基因型的頻率明顯高于對(duì)照組，C/C基因型的頻率明顯低于對(duì)照組，基因型頻率比較χ2＝7.934，P＝0.005，OR＝2.148, 95%CI1.255～3.675。在等位基因頻率比較中，IA組與對(duì)照組差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：IA組T等位基因頻率（64.0%）明顯高于對(duì)照組（56.4%），C等位基因的頻率（36.0%）明顯低于對(duì)照組（43.6%），等位基因頻率與對(duì)照組比較χ2＝6.278，P＝0.012，OR＝1.378，95%CI1.072～1.771。說(shuō)明rs1333040與漢族人群IA發(fā)病密切相關(guān)，其風(fēng)險(xiǎn)性主要來(lái)源于T等位基因。未發(fā)現(xiàn)CDKN2A-CDKN2B區(qū)域所檢其它SNP位點(diǎn)與漢族人群的IA發(fā)病相關(guān)（表3）。

表3 IA組與對(duì)照組SNPs基因型與等位基因頻率比較一覽表Tab.3 Comparison of SNPs genotype and allele frequency between IA group and control group

2.3 IA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的多因素分析 如前所述，在IA組rs1333040位點(diǎn)的T/T基因型頻率明顯高于對(duì)照組，因此對(duì)rs1333040位點(diǎn)TT＋CT基因型行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與基因型C/C比較，應(yīng)用Logistic回歸校正性別、年齡及其他環(huán)境危險(xiǎn)因素（飲酒、吸煙等）后TT＋CT基因型頻率IA組和對(duì)照組比較差異仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs1333040位點(diǎn)的TT基因型及T等位基因是IA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其患病風(fēng)險(xiǎn)率增加至1.796倍。多發(fā)IA和單發(fā)IA亞組比較發(fā)現(xiàn)，與上述各SNP位點(diǎn)的基因頻率分布均無(wú)明確相關(guān)。在亞組分析中，rs2891168位點(diǎn)上，不同基因型中患者的IA發(fā)生部位存在差別，其A/A基因型與前循環(huán)分布區(qū)的IA密切相關(guān)（P＝0.025）。未發(fā)現(xiàn)其它所檢SNP位點(diǎn)不同基因型的患者在IA發(fā)生部位上的差別。

2.4 按性別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的亞組分析 在校正了年齡、血壓、吸煙、飲酒等影響因素后，rs1333040 T/T基因型與漢族男、女IA發(fā)病均密切相關(guān)，但與女性IA的關(guān)聯(lián)程度更高（表4）。

表4 IA患者SNPs基因型性別差異效應(yīng)分析Tab.4 Analysis of sex differential effect of SNPs genotypes in IA patients

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，IA的形成、發(fā)展和破裂是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[2,7]。同其它血管疾病類似，其常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素為高血壓、吸煙及飲酒過(guò)量[8]。然而，迄今為止，人們對(duì)IA的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制還知之甚少。

目前國(guó)際上針對(duì)歐洲和日本人群開(kāi)展了關(guān)于IA的大樣本GWAS，并報(bào)道了數(shù)個(gè)與IA相關(guān)聯(lián)的區(qū)域，分別位于染色體18q11.2、13q13.1、10q24.32、8q11.23-q12.1以及9p21.3[7,9]。其中，有數(shù)項(xiàng)獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區(qū)域不僅與北歐、日本人群的IA相關(guān)，而且與缺血性腦卒中、心肌梗死、腹主動(dòng)脈瘤、2型糖尿病等多種血管疾病存在關(guān)聯(lián)[3-5]。雖然該區(qū)域的功能尚不明確，但有人推測(cè)位于該區(qū)域的假定危險(xiǎn)基因可能與細(xì)胞周期分裂過(guò)程相關(guān)，在人體血管的形成和修復(fù)方面發(fā)揮著重要的作用[9]。因此，CDKN2A-CDKN2B被認(rèn)為是最有希望發(fā)現(xiàn)IA等血管疾病關(guān)鍵性致病基因的區(qū)域之一[4,10]。

本研究證實(shí)了位于9p21.3的CDKN2A-CDKN2B區(qū)域4 個(gè)與血管疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)（rs1333040、rs2891168、rs2383207和rs10757278）中，rs1333040與漢族人群IA發(fā)病密切相關(guān)，是IA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，本研究表明，rs1333040 T/T基因型與漢族男、女IA發(fā)病均密切相關(guān)，但與女性IA的關(guān)聯(lián)程度更高，提示基因和性別在IA發(fā)生中具有一定的影響作用。絕大多數(shù)年齡段（＜85 歲）的缺血性或出血性卒中，均為男性高發(fā)，這與男性具有更高的卒中危險(xiǎn)因素（如吸煙、飲酒等），且內(nèi)源性雌激素可能對(duì)卒中有保護(hù)作用有關(guān)[11-12]。然而，如前所述，SAH在流行病學(xué)方面卻具有與其它腦血管疾病截然不同的特點(diǎn)。其中最為突出的是，女性較男性更易發(fā)生SAH。迄今為止，女性易發(fā)生IA破裂導(dǎo)致SAH的機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)外也罕有這方面的研究報(bào)道。Lin等[13]通過(guò)研究，證實(shí)染色體9p21對(duì)于亞臨床性動(dòng)脈粥樣硬化存在性別差異性的遺傳效應(yīng)，說(shuō)明發(fā)病率的性別差異可能有其相應(yīng)的遺傳學(xué)機(jī)制。本研究通過(guò)對(duì)CDKN2A-CDKN2B區(qū)域的關(guān)聯(lián)分析，從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步詮釋女性易患IA及SAH這一流行病學(xué)現(xiàn)象的原因，為IA流行病學(xué)研究提供了遺傳學(xué)依據(jù)，也為今后開(kāi)展上述區(qū)域IA相關(guān)位點(diǎn)的功能研究奠定基礎(chǔ)，具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

但是，實(shí)現(xiàn)以基因?yàn)閷?dǎo)向的IA及SAH個(gè)體化預(yù)防、診療仍然任重道遠(yuǎn)。今后，在本研究的基礎(chǔ)上，可以在以下方面進(jìn)一步深入探討：首先，本研究結(jié)果提示rs1333040與漢族人群IA發(fā)病密切相關(guān)，是IA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但腦血管病屬于多基因遺傳病，該SNP與其它易感基因之間是否存在交互作用尚不得而知，有待于將來(lái)進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。其次，腦血管病病因復(fù)雜，是由遺傳與環(huán)境共同作用而致病的。今后應(yīng)建立環(huán)境-基因、基因-基因、基因-基因-環(huán)境交互作用的模型，進(jìn)行多因素交互效應(yīng)的探索分析，為IA的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后提供更為詳實(shí)和客觀的分子流行病學(xué)資料。此外，今后應(yīng)開(kāi)展上述區(qū)域IA相關(guān)位點(diǎn)的功能研究，明確上述SNP對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)以及功能的影響，從而為最終闡明IA的發(fā)病機(jī)制及遺傳易感性機(jī)理打下理論基礎(chǔ)。