李靜，張文理 ，張偉，王冰，王偉

（1 青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南；3 青島市中心醫(yī)院，山東 青島）

0 引言

為提高藥品質(zhì)量，保證用藥療效，對(duì)補(bǔ)腎活血顆粒進(jìn)行高效液相特征指紋圖譜試驗(yàn)研究，并對(duì)其特征指紋圖譜中可辨析的19 個(gè)共有峰中的5 個(gè)色譜峰進(jìn)行了成分標(biāo)定和藥材來源初步歸屬，為全面控制該制成品制劑質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，包括G1322A 型在線脫氣機(jī)，G1313A 型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315A 型DAD 檢測器，G1316A 型柱溫箱（美國Agilent 公司）；CPA225D 型十萬分之一電子分子天平（德國Sartorius 有限公司）；Agilent HCC18 色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)。

1.2 試藥

丹參酮ⅡA 對(duì)照品（批號(hào)：110766-201520）；芍藥苷（批號(hào)：110736-201438）；馬錢苷（批號(hào)：11640-201606）；補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：110739-201617）；黨參炔苷（111732-201206）；梓醇（110808-201210）；異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：0738-201313）；丹參素鈉（110855-201412）；齊墩果酸（批號(hào)：0709-9803）均購自中國食品藥品檢定研究院。

13 批次補(bǔ)腎活血顆粒批號(hào)為S1(160722)、S2(160723)、S3(160724)、S4(160725)、S5(160726),S6(160728),S7(160729)、S8(160730) 、S9(160731)、S10(160801) 、S11(160802)、S12(160803)、S13(160804)，甲醇、乙腈為色譜純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

黑順片（產(chǎn)地：陜西 批號(hào)：150901）；酒山茱萸（產(chǎn)地：浙江 批號(hào)：201511010）炒葶藶子（產(chǎn)地：河北 批號(hào)：201505010）；鹽補(bǔ)骨脂（產(chǎn)地：江蘇 批號(hào)：151002）； 熟地黃（產(chǎn)地：201510062 批號(hào)：201510062）； 赤芍（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古 批號(hào)：201511035）；大棗（產(chǎn)地：河北 批號(hào)：150901）；黨參（產(chǎn)地：甘肅 批號(hào)：160116）；黃芪（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古 批號(hào)：151016）；丹參（產(chǎn)地：山東 批號(hào)：151112）。

處方藥材來自青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)藥劑科中草藥房（浙江安國市平安藥業(yè)有限公司），經(jīng)本院張偉主任中藥師鑒定符合2015 年版《中國藥典》相關(guān)項(xiàng)下要求。

2 試驗(yàn)部分

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent HC-C18 (4.6×250 mm，5 μm)；流 動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，按表1 程序進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.8 ml/min；檢測波長：230 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：6 μl。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取丹參酮ⅡA、芍藥苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素0.5 mg，置10 ml 容量瓶中，加適量甲醇超聲處理40min 使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品1 袋（約10 g），研細(xì)，精密稱取約1.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入90% 甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理40min，放冷，再稱定，用90%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 十味藥材溶液的制備

分別各取黑順片、酒山茱萸、炒葶藶子、鹽補(bǔ)骨脂、赤芍、熟地黃、大棗、黨參、黃芪、丹參適量，粉碎，置于具塞錐形瓶中，分別加90%甲醇40 ml，超聲處理40min，濾過，取續(xù)濾液分別作為每味藥材的提取液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取S3 號(hào)樣品供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以9 號(hào)峰（芍藥苷峰）作參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD 在0.33%-1.69%之間，相對(duì)峰面積RSD 在1.03%-3.51%之間，顯示該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取S3 號(hào)樣品9 份，制備成供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。以9 號(hào)峰（芍藥苷峰）作為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.41%-1.77%，相對(duì)峰面積的RSD 是1.07%- 3.12%，顯示方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S3 號(hào)樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定。以9 號(hào)峰（芍藥苷峰）作為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.53%-1.66%，相對(duì)峰面積的RSD 為1.18%-3.94%，表明供試品在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 圖譜采集

依次精密吸取各供試品溶液、各單一對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、單味藥材溶液各5 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.2 共有峰的標(biāo)定

按“2.1”項(xiàng)下方法，對(duì)13 批補(bǔ)腎活血顆粒樣品進(jìn)行試驗(yàn)，觀察所得指紋圖譜，選取吸收信號(hào)較強(qiáng)、穩(wěn)定性好、峰形明顯的19 個(gè)色譜峰，確定為共有峰。其中9 號(hào)峰（芍藥苷峰S）吸收強(qiáng)，峰面積大，受其他峰干擾少，成分確定，故取其作為補(bǔ)腎活血顆粒指紋圖譜的參照峰S。以9 號(hào)峰的保留時(shí)間和色譜峰面積為1，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)

采用對(duì)照品對(duì)照法對(duì)混合對(duì)照品HPLC 圖譜共有峰進(jìn)行指認(rèn)，以相對(duì)保留時(shí)間為判斷依據(jù)，19 個(gè)共有峰可以指認(rèn)5 個(gè)成分峰，比對(duì)指認(rèn)出馬錢苷、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、丹參酮ⅡA。

2.4.4 樣品相似度評(píng)價(jià)

采用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) (2012.130723 版本)，以對(duì)照譜圖上標(biāo)示的色譜峰作為匹配點(diǎn)，進(jìn)行多點(diǎn)校正，并計(jì)算結(jié)果，13 批補(bǔ)腎活血顆粒指紋圖譜的相似度在 0.926-0.971 之間，平均值為0.949，RSD 值為1.65%。

3 討論

《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定，中藥指紋圖譜系指中藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析方法得到的能夠體現(xiàn)中藥整體特性的圖譜[1]。

中藥質(zhì)量控制是中藥現(xiàn)代化研究的核心問題之一。隨著科技的不斷發(fā)展,中藥的質(zhì)量控制由傳統(tǒng)的單憑經(jīng)驗(yàn)鑒別氣味、口感、色澤等逐步發(fā)展到薄層、紫外、紅外、熒光、色譜等技術(shù)的應(yīng)用。雖然高效液相法得到了廣泛的應(yīng)用,但也局限在單一成分定量上。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段,它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品、成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性[2]。

（1）本實(shí)驗(yàn)對(duì)梓醇、丹參素鈉、齊墩果酸、黨參炔苷也進(jìn)行了對(duì)照品定性研究，但由于其在本流動(dòng)向下未出峰或與其他重合，因此不能將其作為定性研究對(duì)照[3]。

（2）經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，匯總優(yōu)選出處方中藥材的類似流動(dòng)相以及多數(shù)共同的檢測波長，在優(yōu)選波長230 nm 下通過實(shí)驗(yàn)，選出各流動(dòng)相的持續(xù)沖柱時(shí)間，使之在圖譜中出現(xiàn)的色譜峰呈現(xiàn)多樣性。

（3）本實(shí)驗(yàn)對(duì)補(bǔ)腎活血顆粒進(jìn)行了指紋圖譜定性分析方法的初步探索，該方法簡單可靠，此方法可以快速檢測顆粒中的藥材和化學(xué)成分，并為之后的指紋圖譜定量分析研究打下基礎(chǔ)[4-8]。