張 立 ，次仁曲珍，洛 桑，次仁多布杰，阿旺扎西

（1.西藏自治區(qū)農科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850000；2.西藏日喀則市江孜縣農牧綜合服務中心，西藏江孜 857000；3.西藏山南市曲松縣農牧綜合服務中心，西藏 曲松 856000）

羊毛是重要的畜牧業(yè)產品，也是重要的紡織工業(yè)原材料。隨著羊毛紡織技術的不斷提高和人們對自然、高檔、輕薄及柔軟服飾的追求，直徑在21.5 μm以下的細羊毛備受市場青睞。雖然近年來我國的羊毛產量不斷增長，但是高品質羊毛產量不足，羊毛質量參差不齊，羊毛進口量逐年攀升。因此，培育出生產高品質、高產量羊毛的綿羊品種成為綿羊育種的時代需求。分子標記育種是實現(xiàn)高品質綿羊育種的重要輔助手段，能夠大大加快育種進程[1-6]。

羊毛的細度和卷曲度是羊毛的重要性狀，它決定了羊毛產品的紡織品質和經濟價值，是世界羊毛業(yè)評價羊毛質量的主要依據(jù)參數(shù)。羊毛纖維品質決定了羊毛制品的最終質量，尤其是羊毛的細度和彈性直接影響著織物的厚度和彈性。隨著自然、輕薄高質量毛紡織品成為人們對衣物的主流追求，毛紡業(yè)對超細羊毛的要求和需求日益增加。另外，目前人造纖維與羊毛相比較，在纖維彈力和彈力均勻水平方面均占有優(yōu)勢，對羊毛業(yè)和羊毛紡織業(yè)形成有力競爭，制約了毛紡業(yè)的發(fā)展。所以，加快生產高品質細毛型羊只的培育和發(fā)展，提高細毛羊的育種水平，符合市場的需求，具有較大的發(fā)展前景。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

從西藏江孜縣采集53只彭波半細毛羊耳組織。

1.2 樣本基因組DNA的提取和純度測定

使用試劑盒（上海生工生物公司)提取DNA，利用超微量分光光度計 （NANODROP 2000c Thermo SCIENTIFIC）測定基因組DNA的純度和濃度，其A260/A280在1.8～2.0范圍之內，提取的基因組DNA滿足實驗要求。

1.3 引物的設計合成與檢測

根據(jù)GeneBank中綿羊的KAP6.1基因 (登錄號：AY310752)序列，利用Seqman軟件找出突變位點對應在DNA上的位置。利用Primer Design Tool軟件設計引物，用于檢測KAP基因，引物是由上海生工生物公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

PCR 反應體系為 25 μL：上下游引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，2×Taq Master Mix12.5 μL，模板 DNA1 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，57.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 HRM分析與檢測

1.4.1 DNA HRM-PCR擴增。HRM-PCR擴增反應體系為 10 μL：上下游引物（10 μmol/L）各 0.3 μL，2×HRM Analysis Pre Mix 5 μL，模板 DNA0.5 μL。 PCR擴增條件（二步PCR）：第一步15個循環(huán)，第二步25個循環(huán)。擴增后的基因片段用常規(guī)電泳檢測并用Light Scanner TM系統(tǒng)進行分析。

1.4.2 突變樣本的常規(guī)PCR擴增與測序。通過HRM篩選結果，得出不同基因類型。每種基因類型各選取2個所對應的DNA編號，取其DNA進行常規(guī)PCR。常規(guī)PCR與引物特異性檢測時的程序條件和試劑完全一致。擴增產物經電泳檢測后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行DNA測序驗證。

2 結果

2.1 樣本基因組DNA的引物檢測

如圖1和圖2所示，擴增片段長度與預期長度吻合，引物擴增產物沒有產生明顯拖尾及特異性較好。

2.2 HRM分析與基因測序

本實驗利用HRM分析系統(tǒng)對所提取的53組彭波半細毛羊羊耳組織DNA樣品進行HRM分析。KAP6.1基因突變熱點分別在外顯子2和外顯子 8上。

如圖3和圖4所示，可看出KAP6.1基因第1078位點核苷酸的基因由T突變?yōu)镃，其結果與HRM分析結果相一致。

2.3 基因頻率與基因型頻率

根據(jù)測序結果對53只綿羊分型，并統(tǒng)計基因型頻率，結果見表2。

表2 KAP6.1基因型頻率分布

對每個基因型與毛長度進行分析，結果如表3。

表3 KAP6.1不同基因型與長度關聯(lián)分析結果

3 討論

Parsons等[7]認為，KAP6和KAP8基因與細毛羊的產毛量及纖維直徑相關，并推測在KAP6和KAP8同一區(qū)域可能存在控制羊毛直徑的主效基因。劉桂芬[8]和張亞妮[9-10]的研究也表明，KAP1.1、KAP1.3和KAP6.1 基因與細毛羊和絨山羊的部分產毛性狀存在一定的相關性。

4 結論

KAP6.1位點與長度性狀有關，可作為產絨量性狀的首選基因。