張林甦 韓忠耀 王傳明 鄧先擴

摘 要： 該研究以新鮮陰地蕨全株為材料，用Illumina HiSeq 2500平臺進行全轉錄組測序，干凈序列經組裝后得單一基因（Unigene），將Unigene在非冗余蛋白/核酸數據庫（nonredundant protein database， NR）、核酸序列數據庫（nucleotide sequence database，NT）、基因本體論數據庫（gene ontology，GO）、蛋白質真核同源數據庫（clusters of eukaryotic orthologous groups，COG）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、蛋白質序列數據庫SwissProt和Interpro進行生物信息學分析。結果表明：共獲得干凈序列 6.67 Gb ，組裝后得到 58 646 個Unigene，平均長度為1 023 bp，Unigene在上述數據庫的總體注釋率為69.25%。其中，在GO數據庫中，20 762個基因被注釋到生物功能、細胞組分和分子功能3個本體的52個功能組，COG注釋了20 633個基因并將其劃分為25個功能簇;在KEGG數據庫中，比對注釋了29 377個基因，可劃分為5個大類、19個亞類代謝途徑，據此篩選出八類植物激素信號轉導相關的41個基因家族。通過比對共得到43 102個編碼序列（coding sequence，CDS），平均長度為749 bp， N50為1 137;篩選到60個轉錄因子（transcript factor，TF）家族共1 502個轉錄因子基因;共發(fā)現17 195 個單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位點，其中堿基轉換11 122個，顛換6 073個;發(fā)現了8 245個簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR），數量最多的為二核苷酸重復和三核苷酸重復。這些結果從功能和結構方面提供了陰地蕨全轉錄組信息和涉及植物激素信號轉導的潛在基因，為進一步深入研究陰地蕨的生長發(fā)育、遺傳、品種鑒別等提供了分子生物學的基礎數據。

關鍵詞： 陰地蕨， 轉錄組， 植物激素， 信號轉導， 基因篩選

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0536-10

Abstract： Botrychium ternatum is a commonly used folk medicinal plant， its growth and development have some typical representative characteristics of some fern plants. But researches on it mainly focus on chemical constituents， clinical and pharmacological effects， classification and distribution investigation， few about its molecular biology.Plant hormone is a sort of small signal molecular and has very important function to plant growth and development， and plant hormone signal transduction plays a key role in hormonal equilibrium. To obtain related information， Illumina HiSeq 2500 platform was used to perform transcriptome sequencing and bioinformatics analysis were carried out afterwards. Results showed 6.67 Gb clean reads was obtained and 58 646 Unigenes were assembled with an average length of 1 023 bp. Unigenes were annotated in nonredundant protein database （NR）， nucleotide sequence database （NT）， gene ontology （GO）， clusters of eukaryotic orthologous groups （COG）， Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG），Swissprot and Interpro databases with an overall annotation rate of 69.25%.Through GO annotation， 20 762 genes were annotated to three terms and 52 functional groups. A total of 20 633 genes were divided into 25 functional cluster by COG annotation. Through KEGG analysis， 29 377 genes were mapped to five groups and nineteen sub-groups pathways. In addition， 41 gene families related to eight plant hormone signal transduction pathways were screened. Through BLAST and ESTScan， 43 102 coding sequences （CDS） were found， with average length 749 bp， N50 1 137. 60 transcript factor gene families with total 1 520 genes were screened out， including C3H， MYB，MYB-related， bHLH，AP2-EREBP，WRKY and GRAS. 17 195 single-nucleotide polymorphisms （SNP） were found， including 11 122 transitions and 6 073 transversion. And 8 245 simple sequence repeats were found， among them di-nucleotide repeats and tri-nucleotide repeats rank the top two abundance. These data sets provide functional and structural information of global transcriptome and putative genes involving plant hormone signal transduction， and basic data for further research on the growth， development and variety identification of B. ternatum.

Key words： Botrychium ternatum， transcriptome， plant hormone， signal transduction， gene screening

植物激素是一類信號小分子，對于植物的生長發(fā)育起著重要作用，其通過植物激素信號轉導系統(tǒng)發(fā)揮作用，即內因或外因可促使一系列植物激素基因誘導和表達，作用于相應的激素受體或組件，最終顯現出不同的性狀（蘇謙等，2008）。常見的植物激素有生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜內酯素、茉莉酸和水楊酸等，在這些激素信號轉導系統(tǒng)中有的受體或關鍵組分因互作（interact）或串話（crosstalk）會產生協同或拮抗的作用而使信號途徑網絡化（Ohri et al.， 2015）。比如光信號可以通過與生長素信號途徑發(fā)生串話從而調控根的發(fā)育（Kumari & Panigrahi， 2019），光敏色素作用因子（PIFs）可以響應赤霉素、油菜內酯素、茉莉酸、生長素吲哚乙酸（IAA）、脫落酸、乙烯等信號途徑，通過這個“樞紐”分子將激素信號途徑聯成了復雜的網絡（任小蕓等，2016）。植物激素還可通過表觀遺傳調控促進開花，如赤霉素、茉莉酸、脫落酸和生長素對DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾介導的染色質壓縮起重要作用從而影響開花（Campos-Rivero et al.， 2017）。另外，在植物應對土壤病原菌侵害時也進化出復雜的激素信號網絡來保護自身（Berens et al.， 2017）?？梢娭参锏募に匦盘栟D導系統(tǒng)對植物的生長發(fā)育、防御、環(huán)境適應等具有重要意義。

陰地蕨（Botrychium ternatum），又名一朵云、小春花、蛇不見、郎萁細辛、獨腳蒿、冬草等，屬于陰地蕨科陰地蕨屬，一年生草本藥用植物，多以孢子進行繁殖，其生長發(fā)育具有一定的代表性。在我國民間，尤其是貴州、福建等地常用的一種中草藥，因其具有清熱解毒、止咳、止血等功效，主要用于小兒高熱驚搐、肺熱咳嗽、咳血、百日咳、毒蛇咬傷、目赤火眼、目生翳障等（齊建紅，2012;趙俊華等，2008;阮君山，2002）。目前，對陰地蕨的研究較少，主要集中在化學成分、臨床及藥理作用、分類及分布調查等方面，分子生物學相關的信息較少，限制了更深入的研究。轉錄組（transcriptome）是指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使RNA（mRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）及非編碼RNA（none coding RNA）。隨著測序技術的發(fā)展和普及，轉錄組測序（RNA-seq）已經成為從分子水平研究生物基因及其調控的重要方法。本研究通過高通量測序獲得陰地蕨全轉錄組，通過生物信息學方法對其進行分析，得到陰地蕨轉錄組的整體注釋信息、篩選出植物激素信號轉導相關的潛在基因及其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）和短序列重復多態(tài)性（short sequence repeat polymorphism， SSR）等信息，為進一步從分子水平開展陰地蕨生長發(fā)育、品種鑒定等研究提供了有用的資源。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮、成熟陰地蕨植物全株3株（包含根、莖、葉及孢子，于2016年7月采于貴州省黔南州都勻市郊斗篷山地區(qū)（107°20′—107°27′ E、26°12′—26°16′ N，海拔約1 500 m），經黔南醫(yī)學高等?？茖W校王傳明副教授鑒定為陰地蕨（Botrychium ternatum）。樣品采集后，立即用清水沖洗干凈，吸水紙吸干后放入干冰盒中帶回，以備提取RNA。

1.2 cDNA文庫制備及測序

將植物全株用液氮研磨成粉末，用RNA提取試劑盒（艾德萊公司，北京）提取總RNA并將DNA消化，用帶有寡聚脫氧胸腺嘧啶（Oligo dT）的磁珠富集 mRNA，經瓊脂糖電泳及微量核酸檢測儀NanoDrop檢測合格后用試劑盒依次合成cDNA、純化、修復粘性末端、在3′末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行 PCR 擴增構建cDNA文庫;構建好的文庫經檢驗合格后上Illumina HiSeq 2500平臺進行測序。

1.3 De novo（從頭） 組裝

將測序得到的原始序列（raw reads）去除低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的序列得到干凈序列（clean reads），使用Trinity軟件（v2.0.6）（Grabherr et al.，2011 ）對clean reads進行De novo組裝， 使用Tgicl軟件（v2.0.6）（Pertea et al.， 2003）將組裝的轉錄本進行聚類去冗余，得到單一基因（Unigene）用于后續(xù)分析。

1.4 Unigene功能注釋及分析

為了解Unigene的功能，用生信分析軟件將Unigene在七大功能數據庫中進行注釋：用 Blast（v2.2.23） 進行 NT、NR、COG、KEGG注釋;用SwissProt注釋;用 Blast2GO （v2.5.0）（Conesa et al.， 2005） 以及NR注釋結果進行GO注釋;用 InterProScan5 （v5.11-51.0）（Quevillon et al.， 2005）進行InterPro注釋。根據KEGG 信號途徑 map04075，將經注釋的相關基因進行歸類，即得植物激素信號轉導相關基因。

1.5 轉錄組結構分析

1.5.1 編碼序列（coding sequences，CDS）預測 根據功能注釋結果，按照NR、SwissProt、KEGG、COG的數據庫優(yōu)先順序，挑選Unigene的最佳比對片段作為該Unigene的 CDS 。未能注釋上的Unigene使用預測得到的 CDS 作為模型進行建模，然后使用ESTScan （v3.0.2） （Iseli et al.， 1999）進行CDS預測。

1.5.2 轉錄因子（transcript factor，TF）編碼能力預測 首先，用getorf（EMBOSS：6.5.7.0） （Rice et al.， 2000） 檢測Unigene的開放閱讀框（open reading frame，ORF）;然后，使用hmmsearch（v3.0） （Mistry et al.， 2013） 將ORF比對到轉錄因子蛋白結構域（數據來源于PlantTFDB）;最后，根據PlantTFDB描述的轉錄因子家族特征對Unigene進行TF編碼能力鑒定（Jin et al.， 2017）。

1.5.3 SSR和SNP檢測 首先，用MISA （v1.0）（Thiel et al.， 2003） 對Unigene進行SSR檢測;然后，用HISAT（ v0.1.6-beta）（Kim et al.， 2015） 把clean reads比對到Unigene;最后，使用GATK （v3.4-0）（McKenna et al.， 2010） 檢測 SNP。

2 結果與分析

2.1 測序及組裝結果

使用Illumina Hiseq平臺一共測得總原始序列（raw reads）數據量為55.52 Mb，過濾后得到干凈序列（clean reads）44.45 Mb， clean reads比率達到80.6%，測序深度屬“深度”（high deep，>15 Mb）測序。得到干凈總堿基數 6.67 Gb ，組裝后得到 58 646 個Unigene，平均長度1 023 bp，N50、N70均大于1 000 bp （表1） 。所有Unigene的長度均大于300 bp， 分布在300～400 bp的最多， 占25.5%，大于1 000 bp 的累計占39%（圖1），說明測序連續(xù)性和組裝效果較好。

2.2 Unigene功能注釋

將Unigene進行七大功能數據庫注釋（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot 和 Interpro），注釋結果見表2。在NR（NCBI蛋白數據庫，NCBI protein database）中得到最多注釋（65.4%），總體注釋率為69.25%。根據NR注釋結果統(tǒng)計了注釋物種分布（圖2），在蕨類植物小立碗蘚（Physcomitrella patens）和江南卷柏（Selaginella moellendorffii）中共注釋了24%，跟陰地蕨蕨類植物屬性相符，另外在常用的參比物種北美云杉（Picea sitchensis）中注釋也較高（14.21%），可能跟北美云杉本身的注釋較好有關（Ralph et al.， 2008）。NR、COG、KEGG、Swissprot以及Interpro的注釋結果展示在圖3，在五個數據庫中都注釋上的有12 522個，占全部Unigene 的21.4%。

2.3 GO注釋結果

通過GO注釋將20 762個陰地蕨基因或基因產物賦予三大類術語（term）： 分子功能、細胞組分和生物學過程，GO功能分布如圖3。在生物學過程中涉及基因數量處于前三位的分別是代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cellular process）和單組織過程（single-organism process）。細胞組分中最多的是細胞（cell），最少的是核苷（nucleotide）。分子功能中數量最多的是催化活性（catalytic activity）和結合（binding），其次是轉運活性（transport activity）。

2.4 COG功能注釋

通過與COG數據庫進行比對，將20 633個陰地蕨Unigene進行COG注釋，結果如圖5。聚在一般功能（general function prediction only）的最多（4 559個），包含1 000～2 000個基因的簇有8個，包括翻譯、核糖體結構及生物發(fā)生及轉錄等重要的生命活動，值得注意的是鑒定了995個未知功能（function unknown）基因。

2.5 KEGG通路分析及植物激素信號轉導基因篩選

共有29 377條基因比對到六大類、21亞類代謝通路上（圖6），其中數量最多的是新陳代謝（metabolism）通路，有17 698個基因，占60%;最少的是與人類疾病相關的基因，共141個（陰地蕨屬植物）;與有機系統(tǒng)（organismal system）環(huán)境適應（environmental adaption）有關的基因有1 266個。根據KEGG 信號途徑 map04075，將經注釋的相關基因進行歸類，得植物激素信號轉導相關的候選基因（表3）。

2.6 轉錄組結構

CDS：通過BLAST得到38 212個CDS，用ESTScan方法得到4 890個CDS， 共得到43 102個CDS，平均長度749 bp， N50為1 137。

TF：共篩選到60個轉錄因子基因家族共1 502個TF基因，數量超過100的有C3H MYB 和MYB-related以及bHLH轉錄因子家族，其他較多的還有AP2-EREBP、WRKY、GRAS等轉錄因子。

SNP：共發(fā)現17 195 個SNP位點，其中堿基轉換11 122個，包括A-G 5 452個、C-T 5 670個;顛換6 073個，包括A-C 1 444個、A-T 1 729個、C-G 1 418個、G-T 1 482個。

SSR：最多的是二核苷酸重復，有3 666個;其次是三核苷酸重復，3 439個;接下來依次是單核苷酸重復（563個）、六核苷酸重復（260個）、四核苷酸重復（169個）和五核苷酸重復（148個）。

3 討論

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（責任編輯 何永艷）