楊厚云，劉星鑫，黃顯懷，余麗，王嶸

(安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

0 引言

重金屬離子是土壤污染中主要的污染物之一，其來源主要包括大氣沉降、生活垃圾、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及工業(yè)廢水和廢渣不合理排放，大部分分布在人口密集、經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)[1]。與此同時，礦山地區(qū)大量的游離重金屬離子會滲透到地下水或隨雨水徑流入農(nóng)田中，在農(nóng)田中累積，也會帶來極大的危害[2]。與其他污染相比，重金屬污染由于重金屬離子在土壤中不易流失，且土壤中的微生物很難將其分解轉(zhuǎn)化，極易造成土壤質(zhì)量下降、生態(tài)環(huán)境惡化、以及通過食物鏈對人類的身體健康產(chǎn)生威脅等[3]。另外，由于重金屬在土壤中具有很強的隱蔽性，人們很容易忽略這個問題，隨著工業(yè)的不斷發(fā)展，土壤重金屬污染也更加嚴(yán)重[3]。正因如此，為了對土壤中重金屬離子進行有效地治理，首要的就是需要對其進行檢測分析。應(yīng)用先進的檢測技術(shù)，確定土壤中重金屬污染程度，為治理提供及時有價值的信息迫在眉睫。目前，土壤中重金屬污染的檢測方法包括光譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)分析法等傳統(tǒng)檢測技術(shù)，隨著技術(shù)的發(fā)展，新型的檢測技術(shù)也逐漸涌現(xiàn)，比如酶抑制法、免疫分析法和太赫茲光譜法等。但是這些方法依舊存在一些不足之處，比如費時，儀器昂貴或需要高級設(shè)備等[4]。因此，亟需建立一種簡單方便、經(jīng)濟、高靈敏度、高選擇性和快速的重金屬檢測方法。

微生物燃料電池(MFC)是一種利用微生物的催化氧化作用，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的技術(shù)[5]。它的原理是以有機質(zhì)為電子供體，微生物在細(xì)胞內(nèi)將可降解有機質(zhì)分解為電子和質(zhì)子，并通過呼吸鏈將電子分別依次傳輸?shù)郊?xì)胞膜和轉(zhuǎn)移到陽極上，然后經(jīng)外電路，將電子傳遞到陰極上，最后在陰極表面與電子受體結(jié)合；陽極產(chǎn)生的質(zhì)子從陽極液通過離子交換膜擴散到陰極中，從而形成一個閉合回路，完成MFC降解有機質(zhì)、電子傳遞和產(chǎn)電的過程[6，7]。微生物燃料電池技術(shù)一方面可將污水中的有機污染物去除，另一方面利用微生物的新陳代謝作用，還能產(chǎn)生電能，可同時實現(xiàn)污水處理和能源回收的效果。另外，它還具有反應(yīng)條件溫和、無二次污染、去除有機污染物種類多以及回收能源形式多樣化等優(yōu)點，使微生物燃料電池在產(chǎn)電、污染評價和修復(fù)等方面的研究潛能和應(yīng)用前景十分廣闊[8]。近年來，MFC技術(shù)在有機污水處理、產(chǎn)電、環(huán)境修復(fù)、海水脫鹽及傳感器等領(lǐng)域取得了一定的研究成果，顯示了MFC技術(shù)在環(huán)境眾多領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用潛力[9，10]。MFC傳感器主要利用MFC產(chǎn)生的電流或者電壓作為信號對被分析物分析檢測。相對于傳統(tǒng)傳感器，基于MFC的傳感器更易操作、更加便捷、一般無需樣品預(yù)處理，其能在復(fù)雜體系中實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測，使得這項技術(shù)具有選擇性好、靈敏度高、檢測成本低等優(yōu)點[11]。利用MFC傳感器存在以下優(yōu)勢：首先，MFC利用廢水中的菌株就可以在MFC陽極上生長并產(chǎn)電；其次，產(chǎn)電菌能快速應(yīng)對外界環(huán)境沖擊，從電流或電壓的變化可以明確警示廢水中某一物質(zhì)的影響；再次，MFC可以直接利用廢水產(chǎn)電，使得MFC可以實現(xiàn)長期在線檢測的可能；最后，MFC對不同種物質(zhì)的沖擊有不同的反應(yīng)，據(jù)此可以基本判斷出待測物質(zhì)的類型[5]。

MFC傳感器可直接利用微生物作用產(chǎn)生的可測量電信號來監(jiān)測，不需物理和化學(xué)的轉(zhuǎn)換器。主要包括以下幾種常用方法實現(xiàn)：一是伏安法，即利用電流密度的峰值與目標(biāo)物質(zhì)的濃度呈一定比例關(guān)系來檢測一種或者多種化學(xué)物質(zhì)，具有較高的敏感性。當(dāng)監(jiān)測多種物質(zhì)時，會出現(xiàn)不同的電位峰值[12]。二是電流分析法，即利用電流的變化與目標(biāo)物質(zhì)的濃度變化的關(guān)聯(lián)性來監(jiān)測分析某目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)。當(dāng)微生物通過新陳代謝作用分解目標(biāo)物質(zhì)(特別是有毒物質(zhì))時，會抑制微生物的代謝途徑，從而改變電流的產(chǎn)生[13]。三是電勢分析法，即穩(wěn)定精準(zhǔn)的參比電極產(chǎn)生的電勢與MFC的電極電勢之間的勢能差來監(jiān)測分析目標(biāo)物質(zhì)的變化，具有較高的敏感性和選擇性。但是此法對參比電極要求過高，導(dǎo)致其實際應(yīng)用受到限制[12]。目前，已有的MFC傳感器主要集中于生化需氧量(BOD)檢測的傳感器[14，15]。Kim等人首次將MFC用于實際廢水中BOD的檢測，檢測范圍為20-206 mg·L-1。且具有較強的穩(wěn)定性，可以連續(xù)運行5 a[16]。后來逐漸將MFC應(yīng)用于有毒物質(zhì)的檢測，包括有機農(nóng)藥、芳香烴和金屬離子等。Kim等人構(gòu)建了第一個MFC毒性檢測生物傳感器，在連續(xù)流的情況下，分別對有機磷農(nóng)藥、Pb、Hg和多氯聯(lián)苯進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)都對MFC的產(chǎn)電產(chǎn)生明顯的抑制作用，其中Pb和Hg的檢測范圍為1-10 mg·L-1。[17]上述可見，MFC傳感器可以通過采集的電流變化來間接直觀地反映其中某些化學(xué)物質(zhì)的變化情況，且相比較而言，研究成本較低，反應(yīng)信號直觀可靠。除此之外，還有利用MFC傳感器檢測抗生素、揮發(fā)性脂肪酸、溶解氧以及溫度等，極大拓展了MFC傳感器的應(yīng)用范圍[18]。

本研究構(gòu)建雙室MFC傳感器，以四種較為常見的重金屬離子：Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+為研究對象，利用MFC分別對污染土壤中的金屬離子進行檢測。根據(jù)電流分析法，研究各重金屬離子對MFC產(chǎn)電的影響，并通過調(diào)控重金屬離子的濃度來研究金屬離子濃度與電流之間的關(guān)系，最后進一步分析該MFC傳感器對重金屬離子檢測的可行性，從而為污染土壤中重金屬離子的快速檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗裝置MFC搭建

本研究使用的MFC是H型圓筒玻璃雙室反應(yīng)器，如圖1所示，共兩個反應(yīng)器。兩個80 mL的圓筒形極室被陽離子交換膜(CMI7000，膜國際有限公司，美國)分為陽極室和陰極室。陽離子交換膜用之前需置于0.5 M NaCl溶液中40°C浸泡20 h使其充分膨脹和活化。陽極和陰極電極材料均為4×5 cm2的碳?xì)?，兩極室中分別加入60 mL和50 mL的營養(yǎng)液。碳?xì)诸A(yù)處理是將其置于5%硫酸中80°C處理2 h，以去除碳?xì)稚辖饘匐x子等雜質(zhì)，減少對實驗結(jié)果的影響，之后用蒸餾水清洗干凈后晾干備用。陰陽兩極通過直徑為1 mm的鈦絲連接外電路，經(jīng)測量鈦絲與碳?xì)种g的內(nèi)阻小于5.0 Ω。Ag/AgCl參比電極(高仕睿聯(lián)，天津)放置于陽極室中，用于監(jiān)測陽極電流，用橡膠塞密封兩極室以及固定電極。實驗中通過電化學(xué)工作站進行在線電流監(jiān)測。

MFC陽極接種處理淀粉廢水的厭氧污泥，以乙酸鈉為底物富集產(chǎn)電微生物。陽極中加入的培養(yǎng)液成分見先前報道[19]，陰極室中同樣加入50 mL此培養(yǎng)液。除此之外，陰陽兩極液中還包括50 mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)以及增加兩極液體離子強度所需的100 mM KCl。另外，為了保持陽極液混合良好和避免產(chǎn)生濃度梯度，陽極用磁力攪拌器進行攪拌，速度為450 r·min-1。為了保證陽極室中微生物所需的厭氧條件，每次換完培養(yǎng)基后對陽極室曝氮氣30 min。待馴化完成后，分別往陽極注入已曝氮氣處理后的不同濃度重金屬離子進行實驗。

圖1 實驗所用的MFC反應(yīng)器示意圖

1.2 試劑與儀器

試劑：常規(guī)試劑以及三種重金屬離子藥劑(Mn-Cl2·4H2O、CuCl2·2H2O、FeCl2·4H2O)都購自天津市紅巖化學(xué)試劑廠，CdCl2·2.5H2O購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，以上試劑均為分析純。

污泥和重金屬離子溶液：污泥取自山東淀粉廢水處理廠，用于MFC陽極產(chǎn)電菌富集的種泥；四種重金屬離子溶液用化學(xué)藥劑人工配制來模擬污染土壤重金屬淋洗液。各離子濃度的選取，參考已有文獻報道[6]。

儀器：上海辰華CHI1000C電化學(xué)工作站，AL204電子天平，潔康數(shù)碼超聲波清洗機，上海三申DZ10Z不銹鋼電熱蒸餾水器，湖南赫西H/T16MM臺式高速離心機，上海馳久84-1磁力攪拌器，大龍單道可調(diào)移液器，美國FEI公司SIRION2000掃描電子顯微鏡(SEM)。

1.3 SEM檢測樣品前處理

從兩個反應(yīng)器陽極上切下大小為0.3×0.3 mm2的碳?xì)謽悠?，首先?°C 5%戊二醛溶液中浸泡12 h，然后用不同梯度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、95%和 100%)逐步脫水，每次脫水15 min；分析前樣品需要干燥和鍍金。

1.4 實驗方法

1.4.1 MFC反應(yīng)器產(chǎn)電菌馴化

MFC反應(yīng)器搭建完成后，每隔3-5 d更換一次培養(yǎng)液，方法是將陽極液全部取出并離心，倒掉上清液，保留底部污泥并加入新培養(yǎng)基沖洗后返回到陽極室中。每次更換陽極液的同時，陰極液也一并更換，馴化一個月左右，通過觀察電流的變化來判斷馴化是否成功。所有實驗都在常溫下進行。

1.4.2 不同金屬離子對MFC產(chǎn)電的影響

待馴化結(jié)束后，分別依次向MFC陽極中注入一定濃度的 Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+四種重金屬離子溶液，觀察每種重金屬離子對MFC產(chǎn)電的影響。每種重金屬離子做完之后，同時更換陰極和陽極液，陽極液曝氮氣(N2)30 min以使陽極室保持厭氧。待MFC產(chǎn)電穩(wěn)定之后，進行下一種重金屬離子對MFC產(chǎn)電的影響。

1.4.3 重金屬離子濃度與MFC電流變化的相關(guān)性

在確定重金屬離子對MFC產(chǎn)電有影響之后，嘗試探討重金屬離子濃度與MFC電流變化的相關(guān)性。四種離子分別取不同濃度梯度，注入到MFC陽極室中，觀察電流的變化，探討重金屬離子濃度與電流變化差值的相關(guān)性。實驗操作同1.4.2。電流差值的計算方法是用注入金屬離子后MFC達到穩(wěn)定后的電流值減去注入金屬離子前的MFC電流值，取絕對值即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 MFC反應(yīng)器產(chǎn)電菌的馴化

分別對兩個反應(yīng)器，進行一個月左右馴化后，得到電流隨著時間的變化曲線以及陽極電極材料碳?xì)稚衔⑸镒兓闆r，如圖2所示。從圖2(a)和圖2(b)中可以看出，前半個月的運行周期中，每次換完培養(yǎng)基、運行后，兩個反應(yīng)器(1#和2#)產(chǎn)生的電流都存在較大的波動，說明此時陽極中產(chǎn)電菌還未在碳?xì)稚闲纬沙墒斓纳锬?；通過定期更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)半個月，發(fā)現(xiàn)兩個反應(yīng)器在每次換完培養(yǎng)液運行后，電流波動逐漸消失而變的平穩(wěn)，基本維持在0.014～0.015 mA之間。結(jié)果表明，此時產(chǎn)電菌在碳?xì)蛛姌O上已經(jīng)形成成熟的生物膜[20，21]。

圖2 實驗所用的MFC反應(yīng)器馴化電流圖

通過對馴化前后陽極電極材料碳?xì)诌M行SEM表征，其結(jié)果同樣也佐證上述結(jié)果。圖3(a)為空白碳?xì)諷EM圖，從圖中可以看出，碳?xì)直砻姹容^光滑，無微生物附著；而經(jīng)過一個月馴化后，原來光滑的碳?xì)直砻嫔厦黠@的有微生物附著(見圖3(b)和圖3(c))。根據(jù)前述實驗結(jié)果可知，產(chǎn)電菌已馴化完成，兩個反應(yīng)器運行已達到穩(wěn)定狀態(tài)，可以開展后續(xù)實驗。

2.2 不同金屬離子對MFC產(chǎn)電的影響

根據(jù)已有文獻中的報道[6]，本實驗分別選取了一定濃度的四種常見重金屬離子(Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+)作為目標(biāo)土壤重金屬污染物來研究它們對1#MFC反應(yīng)器產(chǎn)電的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，當(dāng)不同重金屬離子注入MFC陽極中時，MFC電流就會突然增加，隨后會下降至一定值。結(jié)果表明當(dāng)有重金屬離子進入MFC陽極室時，MFC可以通過電流的變化來進行響應(yīng)，反應(yīng)靈敏。為了驗證實驗的重復(fù)性，不同重金屬離子至少重復(fù)3次以上注入至MFC陽極中。從圖中可以看出，隨著每次不同重金屬離子注入，MFC電流都會有不同程度的響應(yīng)(電流變化差值大于0.002 mA)，具有一定的重復(fù)性。另外，從圖4(a)中可以看出，當(dāng)Fe2+注入MFC陽極后，MFC電流最后達到平穩(wěn)時，比注入之前有一定的增加。這可能是因為MFC陽極中微生物可以利用Fe2+，使得重金屬本身具有的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的緣故，進而促進MFC產(chǎn)電[5]；另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子可以有效地改善陽極微生物在電極上的附著和核黃素的生成，增加了MFC中陽極微生物的胞外電子傳遞過程[22]。而其它三種重金屬離子注入后的平穩(wěn)電流較注入前都會略有降低(見圖4(b)、圖4(c)和圖4(d))，說明這些重金屬離子不能被MFC陽極微生物利用，反而可能會對微生物代謝有抑制作用，使微生物的酶鈍化，使之失活，造成產(chǎn)電下降[18]。上述結(jié)果表明MFC可用作對土壤中重金屬離子的實時檢測，且具有一定的靈敏性和重復(fù)性。

圖3 陽極電極材料碳?xì)諷EM表征圖

2.3 重金屬離子濃度與MFC產(chǎn)電變化的相關(guān)性

據(jù)文獻報道，在一定條件下，MFC的電流與陽極室中的可代謝底物的濃度及微生物數(shù)量成正比，且不同底物對MFC陽極微生物的生長與電流變化影響均不同[18]。因此，本實驗對四種不同重金屬離子濃度與2#MFC產(chǎn)電變化值的相關(guān)性進行了研究，結(jié)果見表1所示。從表中可以看出，隨著不同重金屬離子濃度的增加，對應(yīng)的電流值差值(增加或降低)都隨之變大。

為了進一步研究重金屬離子濃度與電流變化差值的相關(guān)性，本實驗以各重金屬離子的濃度為橫坐標(biāo)，電流差值為縱坐標(biāo)，得到了四種重金屬離子濃度與MFC電流變化差值的線性擬合關(guān)系，見圖5所示。從圖中可以看出線性擬合后得到線性方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.980，表明重金屬離子濃度與MFC電流變化差值存在很好的線性關(guān)系，并可用于驗證MFC傳感器的穩(wěn)定性。這與文獻中研究其他重金屬離子濃度與MFC電流變化差值得到的線性方程的相關(guān)系數(shù)R2非常接近，部分結(jié)果甚至高于文獻報道的數(shù)值[5，23]。上述結(jié)果表明MFC傳感器不僅可以實現(xiàn)土壤中重金屬離子的在線快速檢測，還可以通過重金屬離子濃度與MFC電流變化差值存在的線性關(guān)系測出土壤中重金屬離子的濃度，實現(xiàn)定量檢測分析，4種重金屬(Fe2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+)的檢測范圍為 9～40、30～50、2～10、2～10 mg L-1。通過比較發(fā)現(xiàn)，本實驗Cu2+的檢測下限明顯優(yōu)于高艷梅等人的研究結(jié)果，但是Cd2+的檢測下限高于高艷梅等人的研究[5]。根據(jù)王潔芙等人的報道可知，在一定重金屬離子濃度范圍內(nèi)，MFC的自我修復(fù)能力可實現(xiàn)電流在下降后仍能恢復(fù)至穩(wěn)定水平，即存在檢測安全濃度范圍。并在安全濃度范圍內(nèi)，MFC傳感器檢測重金屬離子具有可重復(fù)性和長期性[18]。但由于MFC中電化學(xué)細(xì)菌的新陳代謝和對毒性的適應(yīng)能力是有限的，若金屬離子濃度過高會對MFC造成不可逆的毒害，因此可將高濃度離子通過稀釋至安全濃度范圍內(nèi)等方法來解決這一問題。此外，MFC對重金屬離子的檢測存在檢測下限，對濃度過低的金屬離子會存在不能定性和定量檢測的問題[18]。本結(jié)論是MFC定量分析重金屬離子濃度的初步研究，可為MFC傳感器的實際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。實際土壤中的重金屬不是單一的，且成分復(fù)雜。若將此傳感器運用到實際過程中，還需要進一步的探索和優(yōu)化，包括此方法的穩(wěn)定性、靈敏性和精確性等方面。

表1 四種重金屬離子濃度與MFC產(chǎn)電變化差值

圖4 不同重金屬離子對MFC產(chǎn)電的影響

圖5 四種金屬離子濃度與MFC電流變化差值的線性關(guān)系

3 結(jié)論與展望

本實驗構(gòu)建的雙室MFC傳感器通過重金屬離子對微生物代謝的作用，可快速檢測污染土壤中重金屬離子的存在，具有操作方便，靈敏度高，可連續(xù)在線檢測等優(yōu)點。根據(jù)實驗選取四種重金屬離子的實驗結(jié)果可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，有些重金屬離子(如Fe2+)可以被微生物利用來提高MFC產(chǎn)電性能，而大多數(shù)重金屬離子(如Cu2+、Mn2+、Cd2+)會對微生物產(chǎn)生毒害作用來抑制MFC產(chǎn)電性能。通過比較發(fā)現(xiàn)，實驗結(jié)果與其他研究者研究結(jié)果保持一致。重金屬離子促進MFC產(chǎn)電主要是通過金屬離子促進微生物自身代謝和與電極之間的電子傳遞過程來實現(xiàn)；重金屬離子抑制MFC產(chǎn)電則是有毒物質(zhì)進入MFC后抑制產(chǎn)電菌的代謝過程造成的。同時在一定檢測范圍內(nèi)，重金屬離子濃度與MFC產(chǎn)電變化差值有很好的線性關(guān)系(R2＞0.980)，其原理主要是在一定條件下，MFC的產(chǎn)電量或電流與陽極添加的可代謝底物的濃度或電活性菌數(shù)量成正比。這為MFC傳感器對污染土壤中重金屬定量檢測提供了理論基礎(chǔ)。也說明了MFC傳感器用于污染土壤中重金屬離子的檢測具有較好的適用性。后續(xù)實驗擬從尋找MFC電極材料和離子交換膜替代材料等來進一步提高傳感器性能，深入研究典型干擾物對MFC性能的影響，基于大量實驗繪出干擾補償曲線，用以修正金屬離子濃度檢測擬合曲線，提高MFC傳感器的可靠性和長久性。

近年來，MFC傳感器作為一種新型的檢測技術(shù)，在在線檢測和現(xiàn)場快速檢測方面都展示了巨大的優(yōu)勢。然而，由于存在諸如產(chǎn)電效率低、抗干擾性差和成本高等技術(shù)方面的不足，大部分MFC傳感器依舊還停留在實驗室階段，只有極少部分MFC傳感器可在實際中應(yīng)用。另外，目前MFC傳感器只能對某一已知重金屬離子進行檢測，對含有多種未知濃度的金屬離子的樣品，不能定性和定量檢測，特異性低。鑒于此，未來MFC傳感器應(yīng)從提高靈敏度、構(gòu)建特異性MFC傳感器、增加MFC穩(wěn)定性和恢復(fù)能力以及開發(fā)可降低MFC構(gòu)造成本等方面和MFC對金屬離子的相關(guān)作用機制進行深入的研究，為促進MFC傳感器在實際應(yīng)用中，特別是污染土壤應(yīng)用方面的推廣奠定前期基礎(chǔ)。隨著MFC技術(shù)的深入研究，相信得到一種響應(yīng)快、靈敏度高、價格低廉的MFC傳感器指日可待。