劉正乾，廖錫文，王向坤，周鑫，楊成昆，劉峻奇，朱廣志，彭濤

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科 廣西南寧 530021

根據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）全球新發(fā)病例數(shù)接近110萬人，死亡病例55 萬人，約占所有惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)的6%，在惡性腫瘤中發(fā)病率位列第三，死亡率位列第二[1]。60%以上的CRC 發(fā)生在結(jié)腸[2]，其中，約有30%的結(jié)腸癌患者伴有腸外器官轉(zhuǎn)移，在所有伴發(fā)轉(zhuǎn)移癌的患者中，最常見的轉(zhuǎn)移部位發(fā)生在肝臟，約占70%，男性的發(fā)生概率高于女性[3]。肝轉(zhuǎn)移是導致結(jié)腸癌患者死亡的最主要原因，合并遠處轉(zhuǎn)移的晚期患者，5 年生存率僅有10%～20%[4]。因此，闡明結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的相關機制，并依此發(fā)現(xiàn)其潛在的治療靶點，是目前亟待解決的問題之一。以往的多項研究提示了結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的幾種潛在機制[5-8]，包括：IL-33重塑腫瘤微環(huán)境，激活內(nèi)皮細胞促進腫瘤血管生成；LKB1 激活AMPK、負調(diào)控AKT 信號通路和調(diào)節(jié)基因表達；MEGF6誘導EMT 促進大腸癌細胞生長，抑制細胞凋亡；Arp2 和WAVE2的共定位等。但目前基于全基因組對于此機制較為系統(tǒng)的研究仍然較少，本研究基于對GEO 數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的結(jié)腸原發(fā)癌組織、結(jié)腸癌旁正常組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織的全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)集進行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）分析，探索結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的相關機制，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 倫理認可

本研究使用Gene Expression Omnibus （GEO）數(shù)據(jù)庫中的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的所有數(shù)據(jù)現(xiàn)在都可以在出版物或者演示文稿中不受限地使用。本研究中包含的各基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)集均下載于GEO 公共數(shù)據(jù)庫，而非作者通過對人類參與者或動物所做的任何試驗研究獲得，因此不需要額外的倫理委員會批準。

1.2 數(shù)據(jù)集下載和預處理

結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)集從GEO下載（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；訪問日期：2019年12月27日）檢索式為Gene expression analysis of liver and colon cancer primary tumors and metastasis，選擇其中GSE92914數(shù)據(jù)集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE92914）。GSE92914數(shù)據(jù)集包括結(jié)腸原發(fā)癌組織、結(jié)腸癌旁正常組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織共9組全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)集。

1.3 GSEA分析

以結(jié)腸癌合并肝轉(zhuǎn)移患者的結(jié)腸原發(fā)癌組織、結(jié)腸癌旁正常組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織作為分組變量，使用GSEA-4.0.2 版本分析結(jié)腸原發(fā)癌組織、結(jié)腸癌旁正常組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織全基因組的基因表達變化對于各種生物學功能和通路的影響。本研究使用來自分子特征數(shù)據(jù)庫（molecular signatures database，MSigDB） 的“c5: gene ontology (GO) gene sets（c5.all.v7.0.symbols.gmt）”作為參照基因集進行GSEA 富集分析。Number of permutations 設置為重復1 000次[9-10]。

1.4 統(tǒng)計學分析

GSEA 富集分析會根據(jù)Benjamini-Hochberg 程序校正錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）[11]。|NES|＞1、Norminal-P＜0.01 和FDR＜0.25 的富集結(jié)果被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫GSE92914 數(shù)據(jù)集中獲得3例結(jié)腸癌合并肝轉(zhuǎn)移患者的3 個結(jié)腸原發(fā)癌組織標本、3個結(jié)腸癌旁正常組織標本和3個肝轉(zhuǎn)移灶組織標本的全基因組RNA測序數(shù)據(jù)集，一共獲得3 404個編碼基因。

在以c5 為參照基因集的GSEA 分析中，對比結(jié)腸原發(fā)癌組織和結(jié)腸癌旁正常組織，發(fā)現(xiàn)在患者的結(jié)腸原發(fā)癌組織中可以顯著富集到激素代謝過程、T細胞增殖的正調(diào)控和NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控等生物學功能表現(xiàn)。見圖1。

對比肝轉(zhuǎn)移灶組織和結(jié)腸癌旁正常組織，發(fā)現(xiàn)在患者的肝轉(zhuǎn)移灶組織中可以顯著富集到泛素依賴蛋白分解代謝過程的正調(diào)控、去磷酸化調(diào)節(jié)和磷酸酶活性的調(diào)節(jié)等生物學功能表現(xiàn)。見圖2。

對比結(jié)腸原發(fā)癌組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織，發(fā)現(xiàn)在患者的肝轉(zhuǎn)移灶組織中可以顯著富集到淋巴細胞分化、白細胞分化和電子傳遞活性等生物學功能表現(xiàn)。見圖3。

圖1 結(jié)腸原發(fā)癌組織和結(jié)腸癌旁正常組織以c5參考基因集的GSEA富集分析

圖2 肝轉(zhuǎn)移灶組織和結(jié)腸癌旁正常組織以c5參考基因集的GSEA富集分析

圖3 結(jié)腸原發(fā)癌組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織以c5參考基因集的GSEA富集分析

3 討論

本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫GSE92914全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)集進行GSEA富集分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸發(fā)生癌變的機制及其后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的機制可能分別與機體不同的生物學功能有關。在結(jié)腸原發(fā)癌組織和結(jié)腸癌旁正常組織的分析結(jié)果來看，原發(fā)癌可能與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控有關。Karvellas等[12]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子受氧化應激等機制激活，使重度潰瘍性結(jié)腸炎患者罹患結(jié)直腸癌的風險增加，Wang等[13]研究表明REGγ通過與NF-κB-YAP的相互調(diào)控可促進結(jié)腸癌進展，由此，NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子可能對結(jié)腸癌的發(fā)生具有促進作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)激素代謝過程、T細胞增殖的正調(diào)控也可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，其可能的機制還需要更進一步的探討。

在對比結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶與結(jié)腸癌旁正常組織的富集分析結(jié)果中，所得結(jié)果提示結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生或涉及其他與有異于結(jié)腸原發(fā)癌的途徑，比如本研究發(fā)現(xiàn)的泛素依賴蛋白分解代謝的正調(diào)控。目前已有Ji等[14]研究發(fā)現(xiàn)泛素依賴蛋白可抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，因此促進泛素依賴蛋白的分解代謝過程可能對肝轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生也有促進作用。另外，一些對于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs） 家族的研究表明，MMP2、MMP7、MMP9 等參與了腫瘤細胞外基質(zhì)的重塑，促進腫瘤細胞脫離原發(fā)灶從而加速腫瘤的轉(zhuǎn)移過程[15-17]。因此，細胞外一些蛋白酶的活性增加促進泛素依賴蛋白、基質(zhì)金屬蛋白等分解代謝的加快，從而導致細胞外基質(zhì)的破壞與重塑，有可能是促進結(jié)腸癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機制之一。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能與結(jié)腸癌旁正常組織中某些分子的磷酸化或細胞內(nèi)磷酸酶活性的改變有關，目前去磷酸化與磷酸酶活性的調(diào)節(jié)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移之間的可能機制未見相關報道，仍有待于進一步的實驗驗證。

本研究通過對比結(jié)腸原發(fā)癌組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織的富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生還可能與白細胞分化、淋巴細胞分化有關。Tauriello等[18]研究結(jié)果顯示，缺乏T 細胞浸潤、低Ⅰ型輔助性T 細胞（Th1）活性可增加結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移風險。Wang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過沉默聚腺苷二磷酸核糖水解酶（PARG）可抑制NF-κB 活性，進一步降低IL-10 和TDF-β 的分泌、影響T 細胞和DC 細胞的增殖分化，從而抑制結(jié)腸癌的生長和肝轉(zhuǎn)移。上述兩項研究結(jié)果提示結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生與T淋巴細胞的分化之間可能存在聯(lián)系。在Burlaka 等[17]研究中，發(fā)現(xiàn)當肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時，線粒體、NADPH、NOX、不完全或受損的一氧化氮合酶的電子傳遞鏈可能參與缺血后組織的超氧化物自由基的生成，從而對結(jié)直腸癌腫瘤細胞的微環(huán)境產(chǎn)生影響，促進腫瘤進展。本研究發(fā)現(xiàn)電子傳遞活性的生物學功能改變也可能參與了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，與已有文獻[17]內(nèi)容存在相符之處。

本研究存在一定的局限性：第一，納入本研究的樣本量少；第二，本研究數(shù)據(jù)來源于單一數(shù)據(jù)庫，缺乏基礎實驗驗證，本研究的結(jié)果還有待于進一步的實驗確認。盡管存在上述局限，但本研究的結(jié)果仍可為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)病機制的研究提供一定的線索。

綜上所述，本研究通過利用GEO 數(shù)據(jù)庫中GSE92914 全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)集，運用GSEA對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)病機制進行了初步探索，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生機制相較于結(jié)腸癌原發(fā)灶可能出現(xiàn)了改變，淋巴細胞分化、白細胞分化和電子傳遞活性等生物學功能可能參與了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。