浦舒為 逯 峰 王佳偉 黃 勃① 王小兵 王林桂

γ-氨基丁酸、氯化鉀和5-羥色胺對羊鮑()幼蟲存活、附著和變態(tài)的影響*

浦舒為1, 2, 3, 4逯 峰1, 2, 3, 4王佳偉1, 2, 3, 4黃 勃1, 2, 3, 4①王小兵3, 4王林桂3, 4

(1. 海南大學海洋學院 ?？?570228; 2. 海南省熱帶水生生物技術重點實驗室 ?？?570228; 3. 海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室 ?？?570228; 4. 海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室 ?？?570228)

使用γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)、氯化鉀和5-羥色胺, 進行羊鮑()幼蟲存活、附著和變態(tài)過程中的誘導實驗。結果表明, γ-氨基丁酸對羊鮑幼蟲存活、附著及變態(tài)都有促進作用。γ-氨基丁酸濃度為10–4mol/L時處理72h的附著率(26.27%)和變態(tài)率(22.26%)高于其他組別, 10–6mol/L處理72h存活率(30.84%)高于其他組別。氯化鉀能在高濃度(10–2—10–3mol/L)下誘導附著, 而對變態(tài)和存活沒有影響。氯化鉀濃度為10–3mol/L處理時間為24h和72h的附著率高于其他組別, 分別為11.3%和16.4%。5-羥色胺可誘導附著和變態(tài), 對幼蟲的存活無影響或有抑制作用。5-羥色胺濃度為10–5mol/L處理72h的附著率(20.73%)和變態(tài)率(20.18%)高于其他組別。因此, γ-氨基丁酸可作為羊鮑育種培育過程的有效誘導劑, 可以應用推廣于羊鮑幼蟲的培育過程乃至大規(guī)模生產養(yǎng)殖中。

羊鮑; γ-氨基丁酸; 5-羥色胺; 存活; 附著; 變態(tài)

近年來在鮑幼蟲培養(yǎng)研究中已發(fā)現(xiàn)幼蟲存活率和附著率偏低以及變態(tài)異常等問題(Wenresti, 2003; Wang, 2010), 而高附著率和變態(tài)率在鮑幼蟲生命周期的初始階段顯得十分關鍵(Wenresti, 2003; Stott, 2004; Wang, 2010)。因此, 尋找促進附著變態(tài)的有效解決方案具有重要意義。

許多證據(jù)表明, 外部化學信號可以用來誘導浮游幼蟲附著和變態(tài)(Akashige, 1981; Trapido- Rosenthal, 1986; Wenresti, 2003)。一些化學因子能夠成功誘導鮑幼蟲的附著變態(tài), 如L-甲狀腺素(T4) (Fukazawa, 2001)、溴甲烷(Taniguchi, 1994; Seki, 1997; Kang, 2004), 鉀離子(Baloun, 1984; Kang, 2004), γ-氨基丁酸(Morse, 1979, 1980; Searcy-Bernal, 1998; Laimek, 2008)和5-羥色胺(Pawlik, 1990; Zhao2003; Wang, 2010)。

已有大量研究證明, 化學因素在海洋生物幼蟲的附著和變態(tài)過程中起著重要作用(Akashige, 1981; Trapido-Rosenthal, 1986; Wenresti, 2003)。國內研究人員利用γ-氨基丁酸、氯化鉀等化學物質對盤鮑(柯才煥等, 2001)、皺紋盤鮑(康慶浩等, 2003)、九孔鮑(張靜等, 2009)、耳鮑(Wang, 2010)附著和變態(tài)的誘導進行了研究。γ-氨基丁酸、氯化鉀和5-羥色胺的作用已被證明是某些鮑幼蟲附著和變態(tài)的有效誘導劑, 但鮑幼蟲對這些因素的反應具有物種特異性(Todd, 1994; Keough, 1995; Roberts, 1997; Daume, 1999)。此外, 關于羊鮑幼蟲的相關系統(tǒng)研究較少。本研究的目的是探討γ-氨基丁酸、氯化鉀和5-羥色胺對羊鮑存活、附著和變態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 產卵及生產幼蟲

2014年4—8月在西沙群島海域捕獲殼長(SL)≥600mm的成熟羊鮑()。挑出性腺成熟的個體并繼續(xù)養(yǎng)殖在海南三亞(18°13′N, 109°28′E)的鮑文化農場。約3個月后, 將其清洗以去除真菌, 陰干2h, 然后在經過紫外線和雙氧水滅菌處理的海水中, 緩慢升溫誘導產卵。期間溫度為(28±1)°C、鹽度為33, 在玻璃缸(500L)中充滿過濾海水(FSW), 以30ind./mL的密度貯存受精卵。–24h后采集受精卵發(fā)育的浮游幼蟲并進行計數(shù), 用于后續(xù)實驗。

1.2 試劑配制

為了防止氧化作用, 在實驗開始前用過濾海水分別配置濃度為10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7mol/L的γ-氨基丁酸、氯化鉀和5-羥色胺溶液。γ-氨基丁酸購自鄭州瑞佳食品添加劑公司, 氯化鉀購自廣州化學試劑廠, 5-羥色胺購自上海譜振生物公司。

1.3 實驗設計

在γ-氨基丁酸、氯化鉀和5-羥色胺對羊鮑幼蟲存活、附著和變態(tài)影響的實驗進行前, 準備有充氧功能的玻璃缸(40×30×25cm)以及規(guī)格為3×3cm的塑料板作為羊鮑的附著基質, 并在其中預先準備好藻類, 為幼蟲附著做好準備。每個容器中放入300只幼蟲, 分別設置γ-氨基丁酸、氯化鉀及5-羥色胺濃度為10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7mol/L的實驗組及空白對照組, 相同濃度設置5組平行。實驗過程中, 所有水箱的水溫保持在(28±1)°C, 鹽度為33, 光照強度為500 lx。在實驗進行24h和72h之后, 統(tǒng)計幼蟲的存活率、附著率和變態(tài)率(Wang, 2010)。后期幼蟲牢固附著在基質上, 并能在基質上爬行, 可視為完成附著; 幼蟲面盤萎縮、纖毛脫落或出現(xiàn)圍口殼, 即視為完成變態(tài)(Hahn, 1989; Bryan, 1998; Gapasin, 2004)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件包(SPSS Science, Chicago, Illinois)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。簡而言之, 首先使用Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗, 對幼蟲存活率、附著率和變態(tài)率的原始數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗, 并使用Levene檢驗對方差齊性進行檢驗。如果原始數(shù)據(jù)沒有通過這些測試, 則執(zhí)行平方根或自然對數(shù)轉換。在滿足正態(tài)性和同質性的條件下, 采用一維方差分析(ANOVA)和Tukey’s HSD多重比較分析各組間生存、附著和變態(tài)的相關因素。

2 結果與分析

2.1 γ-氨基丁酸的作用

γ-氨基丁酸對羊鮑幼蟲存活、附著和變態(tài)的影響如圖1所示。結果顯示在低濃度(10–6—10–7mol/L) γ-氨基丁酸的實驗組相較于對照組存活率顯著提高(<0.05, 圖1a)。濃度為10–7mol/L處理24h的實驗組存活率(67.5%)明顯高于其他組別, 濃度為10–6mol/L處理72h的實驗組存活率(30.84%)高于其他組別, γ-氨基丁酸處理24h和72h也對附著率產生顯著影響(<0.05, 圖1b)。γ-氨基丁酸濃度為10–2—10–5mol/L時, 24h和72h的附著率均有顯著提高(<0.05)。在γ-氨基丁酸濃度為10–4mol/L時, 附著速率明顯高于其他組別, 分別為18.26% (24h)和26.27% (72h), 與對照組相比, 10–3—10–5mol/L的γ-氨基丁酸處理72h的變態(tài)率更高(<0.05, 圖1c)。γ-氨基丁酸濃度為10–4mol/L時, 其變態(tài)率明顯高于其他組別, 為22.26%。

2.2 氯化鉀的作用

氯化鉀對幼蟲存活、附著和變態(tài)的影響如圖2所示。10–2—10–7mol/L氯化鉀濃度以及處理24h和72h的存活率無顯著差異(>0.05)。高濃度氯化鉀(10–2— 10–3mol/L)處理24h和72h, 附著率顯著提高(<0.05)。10–3mol/L濃度下附著率明顯高于其他組別, 分別為11.3% (24h)和16.4% (72h), 而10–2— 10–7mol/L氯化鉀處理72h與對照組相比, 變態(tài)率無顯著差異(>0.05)。

2.3 5-羥色胺的作用

5-羥色胺對幼蟲存活、附著和變態(tài)的影響如圖3所示。結果表明, 5-羥色胺在高濃度時(10–2—10–3mol/L)對幼蟲的存活明顯的抑制作用, 在低濃度時(10–4—10–7mol/L)對幼蟲存活無明顯抑制作用, 但濃度為10–5mol/L時存活率有明顯的提高, 24h時存活率為65.2% (<0.05)。5-羥色胺濃度為10–2—10–5mol/L時(24h)、10–4—10–6mol/L時(72h)附著率明顯升高(<0.05)。5-羥色胺濃度為10–5mol/L時, 附著率明顯高于其他組別, 分別為16.34% (24h)和20.73% (72h)。10–4—10–5mol/L的5-羥色胺處理組變態(tài)率高于對照組, 而10–2mol/L的5-羥色胺處理組變態(tài)率明顯低于對照組(<0.05)。5-羥色胺濃度為10–5mol/L時變態(tài)率明顯高于其他組別, 為20.18%。

圖1 六種不同的γ-氨基丁酸濃度(10–2, 10–3, 10 –4, 10–5, 10–6和10 –7 mol/L)以及不同處理時間(24h和72h)對羊鮑幼蟲存活率、附著率、變態(tài)率的影響(%)

注: a. 存活率; b. 附著率; c. 變態(tài)率。誤差線表示標準偏差, 重復次數(shù)=5。列的頂部不同字母表示顯著差異(一維方差分析和圖基HSD測試α=0.05): < b < c < d < e < f < g

圖2 六種不同的氯化鉀濃度(10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6和10 –7 mol/L)以及不同處理時間(24h和72h)對羊鮑幼蟲存活率、附著率、變態(tài)率的影響(%)

注: a. 存活率; b. 附著率; c. 變態(tài)率。誤差線表示標準偏差; 重復次數(shù)=5。列的頂部不同字母表示顯著差異(一維方差分析和圖基HSD測試α=0.05): < b < c < d < e < f < g

圖3 六種不同的5-羥色胺濃度(10–2, 10–3, 10 –4, 10–5, 10–6和10 –7 mol/L)以及不同處理時間(24h和72h)對羊鮑幼蟲存活率、附著率、變態(tài)率的影響(%)

注: a. 存活率, b. 附著率, c. 變態(tài)率。誤差線表示標準偏差; 重復次數(shù)=5。列的頂部不同字母表示顯著差異(一維方差分析和圖基HSD測試α=0.05): < b < c < d < e < f < g

3 討論

相關研究證明一些化學因子在鮑幼蟲附著和變態(tài)的初始階段產生非常重要的影響(Laimek, 2008), 用適當?shù)恼T導劑來誘導幼蟲的附著和變態(tài), 可以增加鮑產量?；瘜W物質通過對軟體動物行為方式或生活方式的影響, 可使更多的幼蟲附著到基質上。因此, 一旦幼蟲探測到化學信號, 它們可能會改變其垂直分布, 并顯著改變附著模式, 使幼蟲集中分布在水體的底部并附著在基質板上(Gross, 1992; Wang, 2010)。因此, 通過掌握這些有促進作用化學物質的來源、化學性質以及產生方面的知識來研究附著和變態(tài)過程具有重要意義(Zimmer-Faust, 1994)。關于KCl和GABA對其他鮑品種如皺紋盤鮑的研究已有報道, 但由于實驗方法條件的不同, 實驗結果也有所差異, 可重復性較差, 無法得出統(tǒng)一結論。GABA的誘導效果優(yōu)于KCl(趙海峰等, 2018)的結論與本研究一致。與5-羥色胺對耳鮑的誘導研究(Wang, 2010)相比, 可以發(fā)現(xiàn)5-羥色胺對羊鮑幼蟲的誘導效果遜于對耳鮑幼蟲的誘導效果。對羊鮑幼蟲附著變態(tài)的研究較少, 相較于皺紋盤鮑, 羊鮑幼蟲的附著率和變態(tài)率較低, 可能是物種差異性的緣故, 具體原因有待進一步研究。

γ-氨基丁酸是已知的可誘導商業(yè)鮑品種的幼蟲附著和變態(tài)的關鍵物質(Searcy-Bernal, 1992; Laimek, 2008)。Morse等(1979)發(fā)現(xiàn), γ-氨基丁酸可在10–6mol/L濃度可以使得98%的幼蟲附著。Stott等(2004)報道, 相對高濃度的2×10–6和20×10–6的γ-氨基丁酸可能會誘導幼蟲成功完成變態(tài)的能力。在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)對羊鮑來說, 與氯化鉀和5-羥色胺相比, γ-氨基丁酸是最有效的誘導劑。γ-氨基丁酸10–7mol/L (24h)處理組的存活率明顯高于其他組別, 10–6mol/L (72h)處理組的存活率明顯高于其他組別。γ-氨基丁酸濃度為10–4mol/L時, 附著率和變態(tài)率均明顯高于其他組別。本研究認為GABA的綜合誘導效果優(yōu)于其他兩種物質。

氯化鉀促進多種海洋無脊椎動物幼蟲附著和變態(tài)的作用已得到確定。例如, Baloun等(1984)研究發(fā)現(xiàn)海水中鉀離子濃度會影響紅鮑()的附著和變態(tài), 鉀離子濃度越高, 幼蟲附著的比率就越高。在本研究中, 氯化鉀作為誘導劑, 對羊鮑幼蟲存活率和變態(tài)率沒有顯著影響。然而, 高濃度氯化鉀(10–2—10–3mol/L)可使羊鮑幼蟲附著率顯著提高, 其中10–3mol/L濃度下誘導附著效果優(yōu)于其他組別。使用氯化鉀成本相較于其他兩種誘導劑較低, 具有較高的性價比。在變態(tài)和附著過程中, 鉀離子對不同物種的影響有所不同(Kang, 2004)。

5-羥色胺是一種神經遞質和調節(jié)劑, 在脊椎動物和無脊椎動物的神經系統(tǒng)中起著重要的作用(Kuffler, 1984; Pawlik, 1990; Zhao, 2003)。現(xiàn)有研究表明, 5-羥色胺可以誘導泥螺 () (Levantine, 1986)和白蝶珠母貝() (Zhao, 2003)幼蟲的變態(tài)發(fā)育。作者在本研究中發(fā)現(xiàn)5-羥色胺對羊鮑是一種有效的誘導劑, 5-羥色胺濃度為10–5mol/L時, 對羊鮑幼蟲附著和變態(tài)的誘導效果優(yōu)于其他組別。相較于其他兩種誘導劑, 綜合考慮5-羥色胺誘導效果略遜。

4 結論

本研究闡明了γ-氨基丁酸、氯化鉀和5-羥色胺對羊鮑幼蟲有著不同的影響。γ-氨基丁酸能夠提升存活率、附著率和變態(tài)率。氯化鉀僅能誘導附著, 對幼蟲的存活和變態(tài)無影響; 5-羥色胺能誘導附著和變態(tài), 但對幼蟲的存活無影響或有抑制作用。γ-氨基丁酸是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經遞質, 它參與多種代謝活動, 具有很高的生理活性。γ-氨基丁酸能抑制谷氨酸的脫羧反應, 使血氨降低, 提高葡萄糖磷酸酯酶的活性, 使腦細胞活動旺盛, 可促進腦組織的新陳代謝和恢復腦細胞功能改善神經機能(Li, 2006)。因此, 經綜合考慮, 10–4mol/L的γ-氨基丁酸效果較優(yōu), 可以作為有效誘導劑應用推廣于幼蟲培育過程中。

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EFFECTS OF GABA, POTASSIUM CHLORIDE, AND SEROTONIN ON LARVAL SURVIVAL, SETTLEMENT, AND METAMORPHOSIS OF ABALONE

PU Shu-Wei1, 2, 3, 4, LU Feng1, 2, 3, 4, WANG Jia-Wei1, 2, 3, 4, HUANG Bo1, 2, 3, 4, WANG Xiao-Bing,3, 4WANG Lin-Gui3, 4

(1. College of Marine Sciences, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Key Laboratory of Tropical Hydrobiology and Biotechnology of Hainan Province, Haikou 570228, China; 3. State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, Haikou 570228, China; 4. Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education in Hainan University, Haikou 570228, China)

The effects of γ-aminobutyric acid (GABA), potassium chloride, and serotonin were examined to determine the possibility of promoting larval survival, settlement, and metamorphosis ofResults show that GABA was able to increase survival, settlement, and metamorphosis. Treatment with GABA at 10–4mol/L for 72h resulted in higher settlement rate (26.27%) and metamorphosis rate (22.26%), while at 10–6mol/L for 72h resulted in higher survival rate (30.84%). Potassium chloride could induce settlement at high concentration (10–2—10–3mol/L) but had no effect on survival and metamorphosis. Even higher settlement rate 11.3% and 16.4% was observed in the 10–3mol/L group treated for both 24h and 72h, respectively. Settlement and metamorphosis could be induced by Serotonin that had no effect or had inhibitory effect on larval survival. Even more higher settlement rate (20.73%) and metamorphosis rate (20.18%) were detected at serotonin concentration of 10–5mol/L for 72h. Therefore, GABA can be used as an effective inducer in seed culture of. It can be applied in larval cultivation process and even mass production and breeding of.

; γ-aminobutyric acid (GABA); serotonin; survival; settlement; metamorphosis

* 海南省重點計劃項目, ZDYF2016089號; 中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(海洋藥), 201207002-03號; 國家高技術研究發(fā)展計劃(863)項目, 2012AA10A412-8號, 2004AA603130號; 國家海洋公益項目, 201105008-7號。浦舒為, 碩士研究生, E-mail: 1030852076@qq.com

黃 勃, 教授, E-mail: huangbohb1@163.com

2019-12-16,

2020-02-29

S968.3

10.11693/hyhz20191200261