羅國(guó)平，孟會(huì)寧，閆夢(mèng)茹，王小寧，薛倩倩，陳 程，高祎凡，馬遠(yuǎn)濤，陳夢(mèng)圓

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021； 2.山東步長(zhǎng)醫(yī)藥銷售有限公司，山東 菏澤 274418)

DOI：10.16664/j.cnki.issn1008-0511.20200108.001網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2020-01-08 08:52:00

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類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA) 是自身免疫性疾病的一種，其病因尚不完全明確，其特征為慢性進(jìn)展性的關(guān)節(jié)滑膜炎癥，引起關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，若病情未得到較好的控制與治療，將會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和殘疾及多器官功能衰竭[1]。因此，RA的治療是研究者一直想要攻破的難題[2]。

雷公藤具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、通絡(luò)止痛的功效[3]。臨床上常用雷公藤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、麻風(fēng)反應(yīng)等。雷公藤甲素(TP)又名雷公藤內(nèi)酯，是中藥雷公藤的主要活性成分，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤和抗生育等活性。目前投入臨床上使用的TP單體制劑較少，常用的是雷公藤片和雷公藤多苷片，但不同廠家甚至同一廠家不同批號(hào)的藥物其TP含量相差較大，加上雷公藤片和多苷片中成分復(fù)雜，不易控制，降低了用藥的安全性。因此，研究TP單體制劑顯得非常有意義。但是，TP存在難溶于水，生物利用度低、有效治療量小、治療窗窄等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)是其具有肝臟、腎、心臟和生殖系統(tǒng)等多臟器毒性的主要原因之一[4-5]。為此，作者考慮通過(guò)改變給藥方式和改進(jìn)劑型來(lái)克服以上問題，即將TP包載于熱敏醇質(zhì)體中并制成經(jīng)皮給藥的凝膠劑。熱敏醇質(zhì)體是一種新型藥物載體，除具備醇質(zhì)體的特點(diǎn)外(如能延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，降低藥物的毒性，提高治療指數(shù)，同時(shí)其良好的變形性和流動(dòng)性可促進(jìn)藥物的穿透性，是一種高效的透皮載體[6-7])，還具有熱敏性，即當(dāng)外界溫度低于質(zhì)膜磷脂液晶態(tài)的相變溫度(tm)時(shí)，包載在熱敏醇質(zhì)體中的藥物基本不釋放，而當(dāng)外界溫度大于或者等于tm時(shí)，膜的流動(dòng)性和通透性均會(huì)增大，內(nèi)部被包載的藥物大量快速釋放，形成較高藥物濃度[8]，提高藥物的治療效果。作者主要介紹雷公藤甲素?zé)崦舸假|(zhì)體的制備工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

雷公藤甲素原料藥：質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%，西安匯林生物科技有限公司；雷公藤甲素對(duì)照品：批號(hào)B20709，上海源葉生物科技有限公司；大豆卵磷脂、膽固醇：藥用規(guī)格，山東巨榮生物工程有限公司；乙醇：體積分?jǐn)?shù)95%，1,2-丙二醇：分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；吐溫-80：化學(xué)純，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；透析袋：6 mm，截留分子質(zhì)量14 000Da。

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀：Agilent 1260，美國(guó)安捷倫科技有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)：TG-1650-WS，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)：SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：BT125D，賽多斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；馬爾文激光粒度儀：ZEN-3600Malvern，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZHWY-100B，上海智城分析儀器制造有限公司；差示掃描量熱儀：DSC1，METTLER-TOLEDO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ρ(雷公藤甲素)的測(cè)定

采用HPLC法，色譜柱：Agilent 5 TC-C18，150 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：V(水)∶V(甲醇)=40∶60；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。另取雷公藤甲素對(duì)照品，加甲醇分別配成質(zhì)量濃度為0、19.92、33.20、53.12、79.68 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積(A)，以雷公藤甲素的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.2 復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的制備

天然大豆卵磷脂和膽固醇制備醇質(zhì)體具備一定的熱敏性能，且其安全易得、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定易于保存，適合普遍應(yīng)用，故選用大豆卵磷脂和膽固醇為囊材制備熱敏醇質(zhì)體[9-10]。采用乙醇注入-超聲法[11-12]：取TP原料藥、大豆卵磷脂、膽固醇適量，精密稱定，置于燒杯中，加入20 mL二醇相(無(wú)水乙醇和1,2-丙二醇)，超聲溶解作為油相；取24 mL磷酸鹽緩沖液 (PBS)作為水相，用注射器吸取水相溶液，攪拌(轉(zhuǎn)速為100 r/min)條件下，于液面以下緩慢勻速注入到上述預(yù)熱至30 ℃的油相中，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間，取出并超聲處理(250 W，40 kHz)一定時(shí)間，冷藏，備用。

1.2.3 熱敏醇質(zhì)體制備工藝優(yōu)化

1.2.3.1 囊材中m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)的考察

(1)不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)對(duì)熱敏性的影響

分別按照1.2.2方法制備復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，其中m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1、9∶1、12∶1，其他條件一樣。熱敏性評(píng)價(jià)方法分別采用DSC法和體外釋藥法。

DSC法：分別取上述制備的3組復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，離心，取沉淀真空干燥后置于鋁制坩堝內(nèi)，在體積分?jǐn)?shù)99.99% N2氛圍下，升溫速度為1 ℃/min，在25～50 ℃檢測(cè)熱敏醇質(zhì)體的熱量變化。

體外釋藥法：采用透析法[13]進(jìn)行體外釋藥實(shí)驗(yàn)。分別取上述制備的3組復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體2 g，放入經(jīng)處理的透析袋中，扎緊透析袋兩端，將透析袋放入100 mL含有體積分?jǐn)?shù)1%聚山梨酯-80的PBS溶液(pH=7.4)中，分別于25、37和43 ℃ 3個(gè)溫度條件下測(cè)定釋放度，取樣時(shí)間點(diǎn)分別為0.5、1.5、3.0、5.0、8.0、12.0 h，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積釋藥率為縱坐標(biāo)繪制釋藥曲線，通過(guò)對(duì)比不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)制備的醇質(zhì)體在不同溫度條件下的釋藥曲線來(lái)分析其熱敏性能。

(2)不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)對(duì)雷公藤甲素包封率的影響[14]

分別按照1.2.2方法制備復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，其中m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1、9∶1、12∶1，其他條件不變。雷公藤甲素的包封率測(cè)定采用超速離心法，計(jì)算公式見式(1)。

(1)

式中：mt為投入的雷公藤甲素質(zhì)量，mg；mr為未包封進(jìn)入醇質(zhì)體內(nèi)的雷公藤甲素質(zhì)量，mg。

1.2.3.2V(無(wú)水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)的考察

(1)V(無(wú)水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)對(duì)包封率的影響

分別按照1.2.2方法制備復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，其中V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3、5∶5、3∶7，其他條件不變，分別測(cè)定雷公藤甲素的包封率。

(2)V(無(wú)水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)對(duì)變形性的影響

分別按照1.2.2方法制備復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，其中V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3、5∶5、3∶7，其他條件不變。醇質(zhì)體變形性的測(cè)定方法為取5 mL雷公藤甲素?zé)崦舸假|(zhì)體混懸液和5 mL PBS，分別測(cè)定在0.8 MPa的壓力下每1 min通過(guò)0.22 μm微孔濾膜的體積，變形性(D)的計(jì)算公式見式(2)。

(2)

式中：V1表示復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體在1 min內(nèi)通過(guò)的體積，mL；V2表示PBS溶液在1min內(nèi)通過(guò)的體積，mL。

1.2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)平均粒徑和粒徑分布的影響

分別按照1.2.2方法制備復(fù)方雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，其中V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3、5∶5、3∶7，其他條件不變。測(cè)定雷公藤甲素光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的平均粒徑和粒徑分布系數(shù)(PDI)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ρ(雷公藤甲素)的測(cè)定

取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖見圖1。

由圖1可知，在上述色譜條件下，供試品溶液中雷公藤甲素的色譜峰與雜質(zhì)峰之間能得到很好的分離，且輔料對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性良好。以雷公藤甲素的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得回歸方程為A=25 268ρ-2.601 4，r=0.999 9，說(shuō)明ρ(雷公藤甲素)=0～79.68 μg/mL線性關(guān)系良好。

t/min圖1 對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液的色譜圖

2.2 囊材中m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)的考察

2.2.1 不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)對(duì)熱敏性的影響

DSC法：不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)制備的醇質(zhì)體DSC圖見圖2。

t/℃圖2 不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)制備的醇質(zhì)體DSC圖

由圖2可知，隨著大豆卵磷脂的比例逐漸減小，熱敏特性越來(lái)越明顯，相變溫度tm值也略有升高。當(dāng)m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1時(shí)，熱敏性最明顯，tm=42.4 ℃。

體外釋藥法：不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)制備的醇質(zhì)體分別在25、37 和43 ℃ 3個(gè)溫度條件下測(cè)定雷公藤甲素的累積釋藥率結(jié)果見圖3。

由圖3可知，3種醇質(zhì)體隨著釋放介質(zhì)溫度的升高雷公藤甲素的釋藥率和釋藥速率均隨之增大，在25 ℃和37 ℃，3種醇質(zhì)體的釋藥曲線在5 h內(nèi)幾乎重疊，5～12 h內(nèi)的釋藥曲線也相差很小，且12 h內(nèi)的累積釋藥率均未超過(guò)50%；在43 ℃，3種醇質(zhì)體中雷公藤甲素在不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋藥率和釋藥速率均明顯比25 ℃和37 ℃大，其中m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1組明顯快于其余2組，其在0～5 h釋放速度快，5～12 h明顯減慢，且12 h內(nèi)累積釋藥率達(dá)90.92%。

t/ha t=25 ℃

t/hb t=37 ℃

t/hc t=43 ℃圖3 不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)制備的醇質(zhì)體在不同溫度下的釋藥曲線

由此表明，以大豆卵磷脂與膽固醇作為醇質(zhì)體的囊材具有一定的熱敏特性，m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1，熱敏性最顯著；該結(jié)果和DSC檢測(cè)結(jié)果相吻合。另外，從醇質(zhì)體的穩(wěn)定性來(lái)看，在室溫保存條件下，醇質(zhì)體較為穩(wěn)定，包載的藥物不易泄露。

2.2.2 不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)對(duì)雷公藤甲素包封率的影響

不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)對(duì)雷公藤甲素包封率的影響，結(jié)果見圖4。

m(大豆孵磷脂)∶m(膽固醇)圖4 不同m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)對(duì)包封率的影響

由圖4可知，大豆卵磷脂的用量逐漸增大時(shí)，包封率明顯減小。m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1時(shí)包封率最高，達(dá)94.78%，載藥量在此時(shí)也最大，故選擇m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1。

2.3 V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)的考察

2.3.1V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)對(duì)包封率的影響

V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)對(duì)包封率的影響，結(jié)果見圖5。

V(無(wú)水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)圖5 V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)對(duì)包封率的影響

由圖5可知，隨著1,2-丙二醇比例的增多(乙醇的比例減少)，包封率逐漸減小，V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3時(shí)包封率最高。是由于醇相與藥物在醇質(zhì)體夾層中存在競(jìng)爭(zhēng)作用，當(dāng)1,2-丙二醇比例增加時(shí)，乙醇的比例會(huì)減少，導(dǎo)致膜材和夾層中藥物的溶解度都降低，影響對(duì)藥物的包封，導(dǎo)致藥物包封率降低。

2.3.2V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)對(duì)變形性的影響

V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)對(duì)變形性的影響，結(jié)果見圖6。

V(無(wú)水乙醇)∶V(1，2-丙二醇)圖6 V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)對(duì)變形性的影響

由圖6可知，隨著1,2-丙二醇比例的增大(乙醇的比例減少)，變形性減弱，V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3時(shí)變形性最好。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)平均粒徑和PDI的影響

超聲時(shí)間對(duì)平均粒徑和PDI的影響，結(jié)果見圖7和圖8。

超聲時(shí)間/min圖7 超聲時(shí)間對(duì)平均粒徑的影響

超聲時(shí)間/min圖8 超聲時(shí)間對(duì)PDI的影響

由圖7可知，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，粒徑有逐漸減小的趨勢(shì)，但差異較小。由圖8可知，PDI隨著超聲時(shí)間的增加而降低，說(shuō)明粒徑分布的均勻性越來(lái)越好；特別是超聲時(shí)間在10～15 min，PDI隨時(shí)間的增加而顯著降低，故選擇超聲時(shí)間為15 min。

3 結(jié) 論

作者以大豆卵磷脂和膽固醇為囊材，無(wú)水乙醇和1,2-丙二醇為柔軟劑，采用乙醇注入-超聲法制備雷公藤甲素?zé)崦舸假|(zhì)體，分別以熱敏性、包封率、變形性和粒度分布等為指標(biāo)優(yōu)化了雷公藤甲素?zé)崦舸假|(zhì)體制備工藝的條件，囊材中m(大豆卵磷脂)∶m(膽固醇)=6∶1，柔軟劑V(無(wú)水乙醇)∶V(1,2-丙二醇)=7∶3，超聲處理時(shí)間為15 min。通過(guò)DSC法測(cè)試?yán)坠偌姿責(zé)崦舸假|(zhì)體的相變溫度為42.4 ℃，體外釋藥法測(cè)試結(jié)果表明，雷公藤甲素?zé)崦舸假|(zhì)體具有良好的熱敏性能。雷公藤甲素?zé)崦舸假|(zhì)體可作為一種皮膚外用給藥系統(tǒng)，除具有良好的熱敏特性和透皮性能外[14-15]，預(yù)期還具有定位釋藥、避免全身給藥的不足和降低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼具熱療和藥物治療雙重特性，將給類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療提供一種新劑型和新制劑。