于祝祝，林 洪，王靜雪*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

三文魚是世界上最重要的商品魚類之一，其中最具代表性的是大西洋鮭，由于其豐富的營養(yǎng)價(jià)值及鮮嫩的生食口感廣受消費(fèi)者青睞。近年來，隨著生活水平的提高以及膳食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，人們對(duì)大規(guī)格、高品質(zhì)的冷鮮三文魚塊的需求逐年上升[1-2]，這就對(duì)其品質(zhì)監(jiān)測及保質(zhì)期的延長提出了更高的要求。但是，切割后的魚體表面存在大量的微生物，會(huì)在貯藏過程中分解魚肉中的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致魚肉的腐敗變質(zhì)，影響產(chǎn)品品質(zhì)及貨架期。Gram等認(rèn)為食物腐敗可能是由化學(xué)反應(yīng)和物理損害引起的，但是食物腐敗的主要原因是微生物生長和代謝導(dǎo)致形成胺、硫化物、醇、醛、酮和有機(jī)酸等，這些物質(zhì)產(chǎn)生令人不愉快和不可接受的異味，微生物是大多數(shù)水產(chǎn)品腐敗的主要原因[3]。J??skel?inen等認(rèn)為魚體死后的第一次變化（ATP、蛋白質(zhì)分解）是由內(nèi)源酶引起的[4]，但微生物活動(dòng)仍是鮮魚腐敗的主要原因[5]。

GB 10136—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性水產(chǎn)制品》[6]中規(guī)定，生食制的動(dòng)物性水產(chǎn)制品的菌落總數(shù)最高限量為105CFU/g?，F(xiàn)有的三文魚研究中，通常測得的三文魚初始微生物數(shù)量在102～104CFU/g之間[7-10]，隨貯藏時(shí)間的延長，菌落數(shù)量逐漸增多，在臨近腐敗時(shí)微生物數(shù)量達(dá)到107CFU/g左右。而在眾多微生物中，特定腐敗菌被認(rèn)為是食品腐敗的主導(dǎo)者[11]。目前對(duì)于三文魚的研究結(jié)果表明，三文魚在大多數(shù)貯藏過程中的特定腐敗菌為假單胞菌，它與三文魚的腐敗情況有著極高的相關(guān)性[7,12-13]。與此同時(shí)，劉娜娜的研究表明，希瓦氏菌與水產(chǎn)品的三甲胺、揮發(fā)性鹽基氮等腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)[14]。因此，在三文魚生產(chǎn)、流通及貯藏過程中，對(duì)菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)量以及希瓦氏菌數(shù)量的監(jiān)控尤其重要。

利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行微生物培養(yǎng)、計(jì)數(shù)往往需要2～3 d的時(shí)間，不利于流通環(huán)節(jié)中對(duì)三文魚的品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測和預(yù)判。預(yù)測微生物學(xué)將微生物學(xué)、數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)技術(shù)等相結(jié)合，用數(shù)學(xué)方法描述微生物數(shù)量與外界環(huán)境之間的響應(yīng)關(guān)系，可以完成對(duì)微生物生長動(dòng)力學(xué)的預(yù)測，從而能夠很好地對(duì)微生物生長進(jìn)行監(jiān)控、預(yù)測產(chǎn)品貨架期，極大降低食品腐敗風(fēng)險(xiǎn)[15]。張新林等將熒光假單胞菌接種于無菌三文魚塊和三文魚汁中，建立了不同溫度條件下三文魚中熒光假單胞菌的生長預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)修正的Gompertz方程擬合所得的各溫度下貨架期方程更優(yōu)[16]，Powell等開發(fā)了用于預(yù)測冷藏溫度（0～10 ℃）氣調(diào)包裝貯存的大西洋鮭魚中細(xì)菌的生長預(yù)測模型[9]。丁婷等研究了不同冷藏溫度下三文魚片中菌落總數(shù)、明亮發(fā)光桿菌、乳酸菌、假單胞菌以及產(chǎn)H2S細(xì)菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)Baranyi and Roberts模型能更好地描述冷藏三文魚片中微生物的生長，Belehradek方程能很好地預(yù)測三文魚片的剩余貨架期[17]。但是，目前已有研究大都停留在擬合獲得參數(shù)、建立模型公式的階段，用戶仍需學(xué)習(xí)基礎(chǔ)模型的使用并且通過計(jì)算僅能獲得時(shí)間點(diǎn)的信息，缺乏對(duì)未來生長趨勢的直觀認(rèn)識(shí)。ComBase是目前已有的預(yù)測微生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，可以在線預(yù)測不同生長條件下多種微生物的生長情況[18]，但所得數(shù)據(jù)大多基于培養(yǎng)基條件，與三文魚本身作為生長基質(zhì)、多種微生物自然生長的狀態(tài)有所不同。因此，如何將三文魚貯藏過程中微生物的生長模型生成軟件、更好地應(yīng)用模型指導(dǎo)生產(chǎn)仍是目前需要解決的問題。

本實(shí)驗(yàn)通過測定不同貯藏溫度（4、10、25 ℃）下大西洋鮭魚片的菌落總數(shù)、假單胞菌和希瓦氏菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)大西洋鮭魚肉上不同微生物的生長規(guī)律。通過一級(jí)模型建立恒溫貯藏過程中微生物數(shù)量與貯藏時(shí)間的關(guān)系，通過二級(jí)模型建立貯藏溫度與微生物生長延滯時(shí)間、最大比生長速率的關(guān)系，進(jìn)而完成對(duì)0 ℃以上條件貯藏大西洋鮭中微生物生長過程的預(yù)測。在公式擬合的基礎(chǔ)上通過Visual Basic語言的編寫，將更多公式和計(jì)算過程由計(jì)算機(jī)后臺(tái)承擔(dān)，實(shí)現(xiàn)用戶僅需輸入初始微生物數(shù)量、溫度、貯藏時(shí)間，即可獲得當(dāng)前微生物數(shù)量以及微生物生長曲線，達(dá)到簡化預(yù)測模型應(yīng)用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大西洋鮭樣品購自東方海洋科技股份有限公司煙臺(tái)三文魚養(yǎng)殖場。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;鐵瓊脂培養(yǎng)基、假單胞選擇性培養(yǎng)基、假單胞選擇性培養(yǎng)基添加劑 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HN-08拍擊式無菌均質(zhì)機(jī) 上海漢諾儀器有限公司;HH-BH電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Axz-260B光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

活魚捕撈后在加工車間按照正常售前處理方式進(jìn)行清洗、去皮、切塊、包裝，以層魚層冰的形式放入保溫箱中運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行切塊，每塊約25 g，采用無菌均質(zhì)袋包裝，放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貯藏，溫度分別為4、10 ℃及25 ℃。貯藏過程中選擇適合的時(shí)間間隔取樣測定。

1.3.2 微生物數(shù)量測定

在特定的貯藏時(shí)間間隔取出裝有魚肉的均質(zhì)袋放入超凈工作臺(tái)中，在裝有25 g魚肉的無菌均質(zhì)袋中倒入225 mL無菌生理鹽水，采用無菌均質(zhì)機(jī)拍擊3 min制成樣品勻液，菌落總數(shù)的測定方法參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[19]進(jìn)行。假單胞菌數(shù)的測定采用假單胞選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，梯度稀釋操作過程同菌落總數(shù)的測定，在培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右、未傾注平板前加入假單胞選擇性培養(yǎng)基添加劑，晃動(dòng)錐形瓶使其混合均勻，然后傾注平板，待平板凝固后翻轉(zhuǎn)，（30±1）℃下培養(yǎng)（48±2）h。希瓦氏菌數(shù)量測定采用鐵瓊脂培養(yǎng)基，（25±1）℃下培養(yǎng)（48±2）h，培養(yǎng)后對(duì)黑色菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)[20-21]。每次測定3～4 組樣品。

1.3.3 微生物生長模型擬合

將大西洋鮭在4、10 ℃和25 ℃貯藏過程中測得的各項(xiàng)微生物數(shù)量分別采用修正的Gompertz模型[16,22]和Baranyi and Roberts模型[17,23]進(jìn)行擬合，得到不同溫度下微生物數(shù)量與大西洋鮭貯藏時(shí)間的關(guān)系，即為微生物生長的一級(jí)模型，選擇最優(yōu)公式擬合結(jié)果進(jìn)行二級(jí)模型的建立。

修正的Gompertz模型見式（1）。

式中：t表示時(shí)間/h;N0表示最初菌落數(shù)（lg（CFU/g））;Nmax表示最大菌落數(shù)（lg（CFU/g））;lag表示生長延滯時(shí)間/h;μmax表示最大比生長速率/h-1。

Baranyi and Roberts模型見公式（2）。

式中：ymax表示微生物數(shù)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的最大值（lg（CFU/g））;μmax、μ0分別表示最大比生長速率/h-1、比生長速率/h-1，當(dāng)ymax＞＞y0時(shí)，μmax=μ0;h表示適應(yīng)因素;t表示時(shí)間/h。

在一級(jí)模型的基礎(chǔ)上，采用Belehradek方程（平方根模型）[24]作為二級(jí)模型反映溫度和微生物生長速率以及生長延滯時(shí)間之間的關(guān)系，具體見公式（3）、（4）。

式中：bλ、bμ為方程系數(shù);λ表示微生物生長延滯時(shí)間/h;T代表貯藏溫度/℃;Tmin是一個(gè)假設(shè)的概念，指的是微生物沒有代謝活動(dòng)時(shí)的溫度，或者是最大比生長速率時(shí)的溫度。Tmin通過延長回歸線與溫度軸相交得到，此時(shí)最大比生長速率為0。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件和OriginPro 8.0軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并選擇合適的模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。選用Visual Basic（VB6 Mini）軟件作為微生物生長預(yù)測程序編寫工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 恒溫貯藏過程中大西洋鮭菌落總數(shù)、假單胞菌及希瓦氏菌生長預(yù)測方程

圖 1 修正的Gompertz模型（A）和Baranyi and Roberts模型（B）擬合大西洋鮭25 ℃貯藏期間微生物數(shù)量變化情況Fig. 1 Evolutionary curves of microorganism counts on Atlantic salmon stored at 25 ℃ fitted to modified Gompertz model (A) as well as Baranyi and Roberts models (B)

利用修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型對(duì)25 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)量和希瓦氏菌數(shù)量隨時(shí)間的變化情況進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖1所示。兩種模型擬合曲線相似度較高，其中，修正的Gompertz模型擬合曲線從生長期進(jìn)入平臺(tái)期的過程更為平緩。擬合所得具體參數(shù)如表1所示，不同模型的擬合效果可由決定系數(shù)（R2）反映，R2越接近1，說明公式與微生物生長情況擬合程度越好。結(jié)果顯示修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型都能夠較好地?cái)M合三類微生物的生長情況，但修正的Gompertz模型在擬合25 ℃貯藏大西洋鮭的假單胞菌生長延滯時(shí)間時(shí)出現(xiàn)負(fù)值，不符合已知微生物生長規(guī)律，Baranyi and Roberts模型擬合結(jié)果能夠更好地反映25 ℃貯藏大西洋鮭中的微生物生長情況。

圖 2 修正的Gompertz模型（A）和Baranyi and Roberts模型（B）擬合大西洋鮭10 ℃貯藏期間微生物數(shù)量變化情況Fig. 2 Evolutionary curves of microorganism counts on Atlantic salmon stored at 10 ℃ fitted to modified Gompertz model (A) as well as Baranyi and Roberts models (B)

圖 3 修正的Gompertz模型（A）和Baranyi and Roberts模型（B）擬合大西洋鮭4 ℃貯藏期間微生物數(shù)量變化情況Fig. 3 Evolutionary curves of microorganism counts on Atlantic salmon stored at 4 ℃ fitted to modified Gompertz model (A) as well as Baranyi and Roberts models (B)

10 ℃和4 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)量和希瓦氏菌數(shù)量隨時(shí)間的變化情況擬合結(jié)果分別如圖2、3所示，修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型擬合曲線基本一致。因此，結(jié)合25 ℃擬合結(jié)果，更適合反映微生物數(shù)量與大西洋鮭貯藏時(shí)間關(guān)系的一級(jí)模型為Baranyi and Roberts模型。

結(jié)合3 個(gè)溫度兩種模型擬合所得參數(shù)（表1），可以看出溫度對(duì)微生物的延滯期以及最大比生長速率影響顯著。隨著貯藏溫度的下降，微生物生長的延滯期延長，最大比生長速率下降：25 ℃貯藏時(shí)微生物的生長延滯時(shí)間都在7 h以內(nèi)，最大比生長速率均在0.1 h-1以上;10 ℃貯藏時(shí)微生物的生長延滯時(shí)間約在20～35 h之間，最大比生長速率在0.08 h-1左右，4 ℃貯藏時(shí)微生物生長延滯期均在60 h以上，最大比生長速率在0.03 h-1左右。與丁婷[25]的研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)擬合所得微生物生長延滯期更長，最大比生長速率更小，推測原因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用大西洋鮭為活魚處理，新鮮程度更高，初始菌落總數(shù)相較于丁婷等的研究結(jié)果減少了1（lg（CFU/g））以上。Teleken等研究了Richards模型擬合魚肉中假單胞菌的生長，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)魚肉的初始假單胞菌數(shù)量和最終假單胞菌數(shù)量在不同貯藏溫度下差別不大，溫度主要影響微生物的最大比生長速率與延滯期[26]，所得結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)較為接近。

表 1 不同貯藏溫度下微生物生長參數(shù)擬合結(jié)果Table 1 Fitting parameters for microbial growth at different storage temperatures

2.2 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長二級(jí)模型擬合

Baranyi and Roberts模型較為準(zhǔn)確地?cái)M合出了4、10、25 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)量以及希瓦氏菌數(shù)量變化情況，但是無法反映其他溫度下3 類微生物的生長，因此需要建立微生物生長參數(shù)與溫度之間的關(guān)系，采用Belehradek方程（平方根模型）進(jìn)行大西洋鮭貯藏溫度與微生物生長延滯時(shí)間、最大比生長速率之間的關(guān)系擬合。

表 2 Belehradek方程擬合大西洋鮭貯藏過程中微生物生長參數(shù)Table 2 Parameters for microbial growth on Atlantic salmon during storage fitted to Belehradek equation

從表2可以看出，Belehradek方程擬合不同溫度下大西洋鮭貯藏過程中的菌落總數(shù)、假單胞菌、希瓦氏菌生長參數(shù)的結(jié)果較好，具體方程分別見式（5）～（7），決定系數(shù)R2均大于0.9。

2.3 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預(yù)測模型的驗(yàn)證結(jié)果

表 3 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預(yù)測模型驗(yàn)證Table 3 Verification of microbial growth prediction model for Atlantic salmon during storage

為貼近實(shí)際應(yīng)用，以GB 10136—2015中規(guī)定的生食制的動(dòng)物性水產(chǎn)制品的菌落總數(shù)最高限量附近測定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，比較預(yù)測值與實(shí)測值，計(jì)算相對(duì)誤差[27-28]。驗(yàn)證溫度除4、10、25 ℃外，還加入了在模型建立過程中未使用的15 ℃，以驗(yàn)證模型在未知溫度下預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。驗(yàn)證結(jié)果如表3所示，菌落總數(shù)在不同溫度下的預(yù)測值與實(shí)測值之間相對(duì)誤差較小，均在10%以內(nèi)，表明該預(yù)測模型能夠較好地預(yù)判大西洋鮭在物流及貯運(yùn)過程中微生物的生長情況[29]。假單胞菌和希瓦氏菌數(shù)預(yù)測值和實(shí)際值之間的相對(duì)誤差在20%以內(nèi)，略高于菌落總數(shù)，推測原因?yàn)椴煌A藏溫度對(duì)假單胞菌和希瓦氏菌生長的影響較大[30]，而菌落總數(shù)為大量微生物累積結(jié)果，受溫度影響較小。

2.4 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預(yù)測系統(tǒng)建立

三級(jí)模型基本上是微生物生長預(yù)測模型的最終形式，是一個(gè)或多個(gè)一級(jí)、二級(jí)模型整合而成的應(yīng)用程序，模型最終會(huì)并入計(jì)算機(jī)軟件的功能當(dāng)中，使得用戶無需了解建模技術(shù)或基礎(chǔ)的一級(jí)和二級(jí)模型，從而使其成為一種在食品工業(yè)和研究中更容易獲取和使用的工具[15]。本研究選用Visual Basic軟件作為大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預(yù)測軟件的程序編寫工具，設(shè)定軟件基本界面及算法后生成應(yīng)用程序，方便使用。

圖 4 大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預(yù)測軟件使用界面Fig. 4 Operation interface of the microbial growth prediction software

軟件使用的界面如圖4所示，設(shè)定可預(yù)測微生物種類為“菌落總數(shù)”、“假單胞菌”和“希瓦氏菌”，可在combo下拉框中選擇想要預(yù)測的微生物種類，填寫貯藏溫度/℃、貯藏時(shí)間/h及初始微生物數(shù)量/（CFU/g）后，單擊“當(dāng)前微生物數(shù)量及生長趨勢”，即可在圖4中右方看到該貯藏溫度下微生物的生長曲線。曲線中紅色圈出點(diǎn)為該貯藏時(shí)間點(diǎn)微生物數(shù)量（目標(biāo)預(yù)測點(diǎn)），且數(shù)值會(huì)出現(xiàn)在文本框中，不僅幫助用戶得知微生物數(shù)量，也通過生長曲線的呈現(xiàn)方便用戶整體感知該貯藏溫度下微生物的生長情況，完成對(duì)未來生長態(tài)勢的預(yù)判，以采取相應(yīng)的措施。該軟件程序部分已完成計(jì)算機(jī)軟件著作權(quán)登記。

3 結(jié) 論

對(duì)4、10、25 ℃貯藏過程中大西洋鮭的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)量及希瓦氏菌數(shù)量進(jìn)行測定，利用修正的Gompertz模型和Baranyi and Roberts模型進(jìn)行變化趨勢的非線性擬合，發(fā)現(xiàn)Baranyi and Roberts模型擬合準(zhǔn)確度較高且符合實(shí)際情況，有利于二級(jí)模型的搭建，因此選擇Baranyi and Roberts模型作為反映恒溫貯藏過程中微生物數(shù)量與時(shí)間關(guān)系的模型，不同溫度下3 類微生物的擬合結(jié)果的R2達(dá)到0.9以上。

為了預(yù)測不同貯藏溫度下微生物的生長情況，利用Belehradek方程（平方根模型）進(jìn)行大西洋鮭貯藏溫度與微生物生長延滯時(shí)間、最大比生長速率之間的關(guān)系擬合，獲得了大西洋鮭貯藏溫度與微生物生長參數(shù)之間的計(jì)算公式，從而完成對(duì)4～25 ℃區(qū)間內(nèi)不同貯藏溫度下3 類微生物的生長預(yù)測。

通過Visual Basic軟件編寫大西洋鮭貯藏過程中微生物生長預(yù)測程序，將Baranyi and Roberts模型和Belehradek方程擬合所得的參數(shù)帶入相應(yīng)公式，獲得了不同貯藏溫度下大西洋鮭中3 類微生物的生長模型，用Visual Basic語言進(jìn)行編寫、生成程序，可以達(dá)到用戶輸入基本貯藏條件后即可獲得微生物數(shù)量及生長曲線的目標(biāo)。