張 倩，朱婷婷，黃明泉，魏金旺,*，吳繼紅，霍嘉穎

（1.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品風味化學重點實驗室，北京工商大學，北京 100048;2.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301）

白酒作為中國的國酒，具有悠久的歷史，在中國傳統(tǒng)文化中占有獨特的地位[1]。白酒中的風味成分僅占總質(zhì)量的2%～3%[2]，但種類繁多，目前在白酒中檢測到的微量化合物已超過2 000 種[3]。這些微量化合物是構(gòu)成白酒獨特風味的物質(zhì)基礎，其中很多是功能性組分[4-8]。結(jié)合中外對飲酒與健康的研究，適量飲用白酒對人體健康有益。當前黨中央和國務院制定了“健康中國”的發(fā)展戰(zhàn)略，向健康白酒發(fā)展是中國白酒發(fā)展的新趨勢[9]，但白酒中功能性組分對人體健康作用機制仍需要進一步研究。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是機體正常代謝產(chǎn)物[10]，ROS濃度過高會導致機體發(fā)生氧化應激，機體內(nèi)累積過多的ROS會造成多種疾病。正常情況下，機體細胞內(nèi)存在著抗氧化防御系統(tǒng)，另外，膳食補充抗氧化活性物質(zhì)對清除機體內(nèi)過多的ROS、維持細胞內(nèi)氧化還原平衡具有重要意義，尤其是機體內(nèi)發(fā)生氧化應激時，補充外源性抗氧化劑尤其重要[11-13]。萜烯類化合物是一類廣泛存在于植物、動物體內(nèi)的碳氫化合物[14]。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的萜烯類化合物在白酒中不斷檢測出，清香型與醬香型白酒中共檢測到69 種，包括萜烯醚、萜烯醇、萜烯酮、萜烯醛和萜烯酯[15-16]，在濃香型白酒中檢測到30 種[17]、藥香型白酒中檢測到52 種[18]，其中藥香型董酒中萜烯含量較高，主要原因是董酒的特殊百草入曲釀制工藝[19]。另外在醬香型、濃香型和清香型原酒、酒醅及大曲中也均檢測到萜烯類化合物[15,17-18]。目前越來越多的證據(jù)表明，萜烯具有抗氧化活性。2012年Bourgou等[20]從精油中分離出4 種萜類化合物，通過氧自由基吸收能力測試證明其體外抗氧化活性。2019年Wang等[21]對葡萄酒中7 種主要萜類化合物進行研究，發(fā)現(xiàn)0.4～8.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍的萜類化合物具有抗菌活性，6.25～50.00 mg/mL萜類化合物具有抗氧化活性，認為其可作為食品工業(yè)天然抗菌劑和抗氧化劑的新潛在來源。萜烯化合物中的雙環(huán)倍半萜類β-石竹烯（β-caryophllene alcohol，BCP）具有重要的功能作用，如2018年Ames-Sibin等[22]證明215 mg/L和430 mg/L BCP可抑制氧化應激及炎癥反應;2019年Aguilar-ávila等[23]的研究表明10 mg/kg BCP可減弱神經(jīng)性疼痛。無環(huán)萜類香葉基丙酮（geranylacetone，GAT）也具有功能活性，2019年Schepetkin等[24]發(fā)現(xiàn)植物精油中含有的GAT可調(diào)節(jié)人體嗜中性粒細胞的反應。雖然已有研究表明BCP和GAT具有功能活性，但所研究的劑量水平都遠高于白酒中的水平，目前為止鮮有對白酒中、低質(zhì)量濃度下BCP和GAT抗氧化作用的研究。

作為我國北方清香型的代表白酒之一，牛欄山二鍋頭酒以清香純正、入口醇甜爽凈、酒體協(xié)調(diào)、尾凈香長的特點深受消費者喜愛[25]。本研究利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（head space solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對13 種牛欄山二鍋頭原酒中的微量萜烯化合物進行定性定量分析，同時按酒中劑量范圍，利用2,2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）誘導的HepG2細胞氧化損傷模型探究其細胞內(nèi)抗氧化活性，以期為健康白酒的進一步研究與發(fā)展提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13 種牛欄山二鍋頭原酒，3 種商品酒（十五年珍品二鍋頭（52度）、百年二鍋頭（45度）、百年紅牛欄山（52度）由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠提供，于4 ℃保存。

BCP、GAT、L-乙酸薄荷酯（色譜純，純度＞98.0%）北京百靈威科技有限公司;NaCl、濃鹽酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司;HepG2細胞 中國疾病預防控制中心;Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基 美國Corning公司;0.25%胰蛋白酶 美國Gibco公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 上海源葉生物科技有限公司;細胞計數(shù)試劑盒CCK-8 日本Dojindo公司;胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、AAPH、抗生素、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、乙醇（高效液相色譜級） 美國Sigma-Aldrich公司;RIPA細胞溶解緩沖液 北京康為世紀生物科技有限公司;過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和總蛋白檢測試劑盒 南京建成生物技術(shù)研究所;ROS、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所;無菌去離子水 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;BL-2200H電子分析天平 島津國際貿(mào)易（上海）有限公司;精密酒精計 河間市黎民居玻璃儀表廠;MPS 2XL固相微萃取自動進樣器 德國Gerstel公司;50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）自動固相微萃取頭美國Supelco公司;7890B-5977A GC-MS聯(lián)用儀、DB-FFAP毛細管色譜柱 美國Agilent公司;PSHJ-5雷磁pH計上海儀電科學儀器股份有限公司;CCL-170B-8細胞培養(yǎng)箱 新加坡ESCO科技有限公司;Costar 96 孔板美國Corning公司;SpectraMax M2e多功能酶標儀美國Molecular Devices公司;TGL-20B-C高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME萃取樣品

樣品處理：用飽和氯化鈉溶液稀釋酒樣至乙醇體積分數(shù)10%，取8.0 mL于20 mL頂空瓶中，并加入10.0 μL內(nèi)標（L-乙酸薄荷酯，終質(zhì)量濃度5.02 μg/L），混勻后進行自動HS-SPME結(jié)合GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：進樣口溫度250 ℃;載氣氦氣流速：1.5 mL/min;不分流進樣;色譜柱DB-FFAP（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。

MS條件：電子電離源（electron ionization，EI），電子轟擊能量70 eV;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度150 ℃;傳輸線溫度與最終柱溫箱的溫度保持一致;全掃描模式，質(zhì)量范圍m/z35～450。

1.3.3 SPME分析條件

參考范文來等[18]的方法，分析條件為：固相萃取頭涂層DVB/CAR/PDMS，膜厚度50/30 μm;樣品在50 ℃下預熱5 min后，將SPME纖維頭插入酒樣上方，50 ℃下吸附萃取45 min。萃取后，將SPME纖維頭迅速插入GC-MS進樣口中，于250 ℃解吸5 min，采用全掃描模式。

1.3.4 定性定量分析

萜烯類化合物的定性主要結(jié)合質(zhì)譜、標準物比對定性。

通過建立標準曲線來定量：先用飽和氯化鈉溶液稀釋無水乙醇至體積分數(shù)為10%，再用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使之與酒樣稀釋后的pH值一致，作為模擬酒樣。將標準化合物BCP和GAT溶解于模擬酒樣以制備已知質(zhì)量濃度的混合標準儲備液，然后梯度稀釋成一系列質(zhì)量濃度的混合標準溶液。取8.0 mL于20 mL頂空瓶中，并加入20.0 μL終質(zhì)量濃度為5.02 μg/L的內(nèi)標物（L-乙酸薄荷酯），依次對各梯度混合標準溶液進行頂空固相微萃取，采用選擇離子法掃描進行測定。最后，以待測物與相應內(nèi)標物質(zhì)的峰面積比為橫坐標，質(zhì)量濃度比為縱坐標，建立內(nèi)標標準曲線。

1.3.5 體外細胞模型法評價萜烯類化合物的抗氧化活性

1.3.5.1 細胞培養(yǎng)

用含有質(zhì)量分數(shù)2.5%血清、50 μg/mL抗生素的DMEM培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞，該細胞屬于單層貼壁生長細胞，待細胞貼壁達到90%時，使用體積分數(shù)0.25%胰酶進行消化傳代，每2～3 d進行一次傳代。取對數(shù)期的HepG2細胞，當細胞密度為1×105個/mL時用于后續(xù)實驗。

1.3.5.2 萜烯化合物對HepG2細胞存活率的影響

為避免萜烯化合物對細胞的毒性作用，確定后續(xù)實驗的樣品濃度，先將細胞接種到Costar 96 孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，于培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞3 次，樣品組加入100 μL不同質(zhì)量濃度的萜烯化合物，對照組加入相同體積的無FBS培養(yǎng)液，每組設置4 個平行，放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度，按照下式計算細胞存活率。

式中：As、Ab、Ac分別為樣品組、對照組、CCK-8對照組吸光度。

1.3.5.3 萜烯化合物對AAPH誘導的氧化損傷細胞中ROS的影響

將細胞接種到Costar 96 孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，于培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)24 h。實驗設為4 組，分別為空白組、樣品組、AAPH組、陽性對照組，每組設4 個平行。清洗細胞后，每孔加入100 μL 10 μmol/L DCFH-DA溶液，在培養(yǎng)箱中孵育20 min后，用無FBS培養(yǎng)液清洗細胞，以除去未進入細胞的DCFH-DA，之后樣品組加入100 μL不同質(zhì)量濃度GAT和BCP，AAPH組和空白組加入100 μL無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)20 min后取出，棄去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞3 次后，將100 μL 200 μmol/L AAPH溶液加入樣品組和AAPH組，同時向空白組加入100 μL無血清培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出，利用熒光酶標儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處測定吸光度[26]。陽性對照組處理較為簡單，加入10 μmol/L DCFH-DA溶液培養(yǎng)并清洗細胞后，加入100 μL 1∶1 000稀釋的Rosup，于培養(yǎng)箱中孵育0.5 h后測定熒光吸光度，其中Rosup為ROS檢測試劑盒中的ROS陽性對照試劑，Rosup是一種混合物，在較短時間內(nèi)刺激細胞可顯著提高ROS水平。

1.3.5.4 萜烯化合物對氧化損傷細胞內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性的影響

將細胞接種到Costar 24 孔板中，每孔加入1.0 mL細胞懸液，于培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)24 h。實驗分為3 組，分別為空白組、樣品組和AAPH組（此評價指標的抗氧化實驗未設置其他陽性對照組，AAPH組即為陽性對照組：細胞經(jīng)過AAPH誘導后，產(chǎn)生強烈氧化應激，使細胞受到較大的氧化損傷，后同）。棄去培養(yǎng)液后，樣品組每孔加入600 μL不同質(zhì)量濃度GAT和BCP，空白組和AAPH組加入等體積的無血清培養(yǎng)液，孵育2 h后，棄去培養(yǎng)液并用PBS清洗3 次，樣品組和AAPH組每孔加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液以引發(fā)氧化應激損傷，空白組加入等體積的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育3 h，棄去培養(yǎng)液并用PBS清洗3 次后，每孔加入150 μL 1.0 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，在4 ℃下裂解20 min，將裂解后的細胞在10 000×g條件下離心10 min，取上清液按照各試劑盒說明書測定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和抗氧化酶（CAT、GSH-Px、SOD）活力。采用BCA試劑盒對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度進行測定。

1.3.5.5 萜烯化合物對氧化損傷細胞中GSH濃度的影響

將細胞接種到Costar 24 孔板中，每孔加入1.0 mL細胞懸液，于培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)24 h。實驗設為3 組，分別為空白組、樣品組和AAPH組。按照1.3.5.4節(jié)處理細胞，加入200 μmol/L AAPH溶液孵育清洗后，每孔加入質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶，在細胞培養(yǎng)箱中消化5 min 后，加入含血清培養(yǎng)基以終止消化，棄去上清液，收集孔板底部細胞碎片轉(zhuǎn)移至離心管，將試劑盒中的蛋白去除劑加入離心管，在-80 ℃和37 ℃條件下，迅速反復凍融3 次，以更好去除細胞內(nèi)蛋白。靜置5 min后，在10 000×g條件下離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書測定GSH濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.3.5節(jié)實驗均進行4 次平行實驗，結(jié)果以平均值±相對標準偏差表示。采用SPSS 17.0軟件中最小顯著性差異法進行顯著性差異分析，柱形圖用Origin 8.5軟件繪制。通過Masshunter B.07.00軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛欄山二鍋頭酒中萜烯類化合物的確定

應用HS-SPME-GC-MS法對13 種牛欄山二鍋頭原酒和3 種商品酒中的萜烯類化合物進行測定，對GAT和BCP兩種化合物通過內(nèi)標物標準曲線準確定量，該方法能夠滿足白酒中痕量萜烯類化合物定量分析要求（表1）。由于β-大馬酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇無標準品，單個化合物的相對含量采用其與內(nèi)標物響應值的比進行半定量分析，各萜烯類化合物的質(zhì)量濃度見表2、3。

表 1 牛欄山二鍋頭原酒中萜烯類化合物的定量參數(shù)Table 1 Quantitative parameters for terpenoids in Niulanshan Erguotou base Baijiu

與之前研究[27]相比，本實驗準確定性定量的微量萜烯化合物有：GAT、BCP、β-大馬酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇，其中GAT為二鍋頭酒中首次檢出。從單個萜烯來看，牛欄山原酒及商品酒中的質(zhì)量濃度一般為一微克每升到幾百微克每升，這5 種萜烯類化合物中，原酒中GAT、BCP、β-大馬酮、β-杜松烯、反式-橙花叔醇平均質(zhì)量濃度分別為0.006 3、0.107 5、0.048 7、0.008 8、0.001 6 mg/L，商品酒中GAT、BCP及反式-橙花叔醇平均質(zhì)量濃度為0.006 8、0.117 5、0.001 9 mg/L。部分萜烯類化合物可能對清香型牛欄山二鍋頭風味有貢獻。香氣活力值（odor activity value，OAV）可以表征化合物對酒體香氣的貢獻，OAV的計算方式是香氣化合物的濃度與該化合物閾值之比，當某化合物的OAV≥1時，認為該化合物對酒樣香氣有重要貢獻，且OAV越大，表明該化合物對酒體香氣的貢獻越大。β-大馬酮在體積分數(shù)46%乙醇水溶液中的閾值僅有0.12 μg/L[27]，經(jīng)計算，13 種牛欄山原酒中β-大馬酮的平均OAV為406.25;BCP在純水中的閾值為64.00 μg/L[28]，其平均OAV為1.68，其余3 種萜烯化合物OAV均小于1，β-大馬酮呈蜂蜜味，BCP呈苔蘚味，這兩種萜烯化合物可能是牛欄山二鍋頭原酒中重要的香氣化合物。

表 2 牛欄山二鍋頭原酒中萜烯類化合物定量結(jié)果（n＝ 3）Table 2 Quantification of terpenoids in Niulanshan Erguotou base Baijiu (n= 3)mg/L

表 3 牛欄山二鍋頭商品酒中萜烯類化合物定量結(jié)果Table 3 Quantification of terpenoids in Niulanshan Erguotou commercial Baijiumg/L

2.2 體外細胞模型法評價萜烯類化合物的抗氧化活性分析結(jié)果

2.2.1 萜烯化合物對HepG2細胞存活率的影響

圖 1 GAT質(zhì)量濃度對HepG2細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of GAT concentration on viability of HepG2 cells

由圖1可以看出，隨著GAT質(zhì)量濃度的升高，細胞存活率整體呈下降趨勢。當GAT質(zhì)量濃度達到0.5 mg/L時，細胞存活率較空白組有顯著性降低（P＜0.05），但此時細胞存活率高于80%，可視為細胞正常存活[29]。當質(zhì)量濃度不小于5 mg/L時，細胞存活率明顯降低，HepG2細胞在此質(zhì)量濃度下已經(jīng)受到較大損傷，不可進行后續(xù)實驗。綜合考慮酒樣中GAT質(zhì)量濃度以及為了探究不同質(zhì)量濃度GAT的抗氧化作用，最終選擇0.005、0.025、0.05、0.5 mg/L進行后續(xù)實驗。

圖 2 BCP質(zhì)量濃度對HepG2細胞存活率的影響Fig. 2 Effect of BCP concentration on viability of HepG2 cells

由圖2可以看出，隨著BCP質(zhì)量濃度的升高，細胞存活率整體呈下降趨勢，直到BCP質(zhì)量濃度達到0.5、5 mg/L時，細胞存活率較空白組顯著降低（P＜0.05），但此時細胞存活率高于80%，可視為正常細胞[29]。當BCP質(zhì)量濃度不小于50 mg/L時，細胞存活率顯著降低，HepG2細胞在此質(zhì)量濃度下已受到較大損傷。考慮到酒樣中BCP質(zhì)量濃度以及高質(zhì)量濃度BCP可以更準確探究其抗氧化作用，最終選擇0.05、0.5、5 mg/L進行后續(xù)實驗研究。

2.2.2 萜烯化合物對AAPH誘導的氧化損傷細胞中ROS的影響

AAPH是一種水溶性偶氮化合物，可以自發(fā)穩(wěn)定產(chǎn)生自由基[30]，其產(chǎn)生的自由基可誘導細胞脂質(zhì)氧化損傷。細胞膜脂質(zhì)的氧化損傷，會導致其完整性受損，同時破壞細胞膜傳輸機制，增加細胞膜的通透性，使得AAPH可以輕易通過細胞膜進入到細胞內(nèi)部，從而引起細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。因此可通過AAPH誘導細胞氧化應激，由細胞內(nèi)ROS水平來反映其氧化損傷程度。針對細胞內(nèi)ROS含量，本研究選用細胞內(nèi)ROS熒光探針DCFH-DA法進行測定。DCFH-DA本身沒有熒光，可自由通過細胞膜，在細胞內(nèi)酯酶的作用下轉(zhuǎn)化為無熒光的DCFH，DCFH不能透過細胞膜，可被細胞內(nèi)的ROS進一步氧化為具有熒光特性的DCF，熒光強度與細胞內(nèi)ROS水平成正比[27]。最后采用熒光酶標儀在指定波長（激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm）處測定吸光度，通過各組熒光強度來確定影響效果。

圖 3 GAT對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)ROS的影響Fig. 3 Effect of GAT on reactive oxygen species in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

圖 4 BCP對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)ROS的影響Fig. 4 Effect of BCP on reactive oxygen species in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如圖3、4所示，空白組未添加AAPH及樣品，細胞產(chǎn)生較低的ROS，經(jīng)過AAPH處理后細胞發(fā)生氧化損傷，產(chǎn)生大量的ROS，熒光強度較空白組增加63.64%，經(jīng)不同質(zhì)量濃度GAT預處理后，細胞內(nèi)ROS熒光強度分別降低36.28%、53.03%、67.62%、72.80%，經(jīng)低、中、高質(zhì)量濃度BCP處理后，ROS熒光強度分別降低62.90%、74.75%、86.91%。結(jié)果表明，經(jīng)不同質(zhì)量濃度GAT和BCP處理后細胞內(nèi)ROS熒光強度顯著下降（P＜0.05），與空白組相比也有顯著性差異（P＜0.05），且呈濃度依賴性，樣品組細胞中ROS的熒光強度甚至低于空白組，這表明這兩種萜烯化合物具有直接清除細胞內(nèi)ROS、防止細胞氧化損傷的作用。

2.2.3 萜烯化合物對氧化損傷細胞內(nèi)MDA含量的影響ROS過剩時會攻擊細胞膜脂質(zhì)，通過與多不飽和脂肪酸的雙鍵反應，引起脂質(zhì)過氧化并導致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的積累。MDA在細胞內(nèi)的含量過高會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)影響其功能，進而引起細胞代謝紊亂及功能障礙最終可能導致細胞凋亡[31]，因此MDA含量可以反映機體細胞氧化損傷程度。

圖 5 GAT對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 5 Effect of GAT on MDA content in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

圖 6 BCP對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 6 Effect of BCP on MDA content in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如圖5、6所示，與空白組相比，AAPH組細胞內(nèi)MDA含量顯著增加（P＜0.05）。樣品組與AAPH組相比顯著降低（P＜0.05），GAT質(zhì)量濃度由低到高各組對MDA抑制率分別為70.11%、90.75%、95.37%、97.72%;BCP質(zhì)量濃度由低到高各組對MDA抑制率分別為95.14%、96.89%、98.44%。對于低質(zhì)量濃度的GAT（0.005、0.025 mg/L）對細胞進行處理后，細胞內(nèi)MDA水平較空白組仍顯著升高，可能是由于GAT質(zhì)量濃度較低，無法將氧化損傷細胞內(nèi)MDA含量降至正常水平。曹光秀等[32]采用線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型，發(fā)現(xiàn)BCP在較高劑量（102、306 mg/kg）作用下，皮質(zhì)中MDA含量降低，由此推斷出可能是由于BCP的抗氧化性對腦缺血再灌注大鼠具有保護作用。本實驗中經(jīng)過低質(zhì)量濃度GAT和BCP處理后細胞內(nèi)MDA含量都有所下降，表明這兩種萜烯化合物對AAPH氧化應激HepG2細胞具有保護作用，能夠維持細胞正常代謝。

2.2.4 萜烯化合物對氧化損傷細胞內(nèi)抗氧化酶的影響

細胞內(nèi)酶抗氧化系統(tǒng)包含SOD、GSH-Px、CAT等，用以清除外源進入或細胞內(nèi)產(chǎn)生的各種ROS分子和自由基，從而維持機體的氧化還原動態(tài)平衡。當機體受到各種有害刺激時，自由基會大量產(chǎn)生，超出了抗氧化系統(tǒng)的清除能力就會導致機體處于氧化應激狀態(tài)，造成氧化損傷[33]。SOD可催化超氧陰離子自由基生成過氧化氫和氧，生成的過氧化氫繼續(xù)被CAT和GSH-Px兩種抗氧化酶催化生成水和氧[34]，從而降低機體氧化應激水平，防止自由基對機體造成損傷[35]。

表 4 萜烯對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)抗氧化酶的影響Table 4 Effect of terpenoids on antioxidant enzyme activities in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如表4所示，與空白組相比，AAPH組3 種抗氧化酶的活力均顯著性降低，SOD、GSH-Px、CAT活力分別降低45.88%、56.89%、66.99%，表明經(jīng)AAPH處理后，細胞產(chǎn)生氧化損傷，激發(fā)了HepG2細胞內(nèi)酶氧化應激。樣品組與AAPH組相比3 種酶活力有顯著性增加，不同質(zhì)量濃度GAT給藥組SOD活力增加84.46%～212.46%，GSH-Px活力增加128.01%～189.99%，CAT活力增加201.47%～490.20%。值得注意的是，添加0.005 mg/L GAT后，樣品組中3 種酶活力與空白組相比無顯著性差異（P＜0.05），本次研究中13 種牛欄山二鍋頭原酒、3 種商品酒中GAT的平均質(zhì)量濃度分別為0.006 34 mg/L和0.006 8 mg/L，結(jié)果表明酒中該化合物的劑量可以使氧化損傷細胞內(nèi)抗氧化酶活性恢復到正常水平。經(jīng)不同質(zhì)量濃度組BCP處理后，SOD活力增加120.00%～320.92%，GSH-Px活力增加124.05%～247.91%，CAT活力增加217.65%～677.45%。牛欄山二鍋頭原酒及商品酒中BCP平均質(zhì)量濃度分別為0.107 5、0.117 5 mg/L，該質(zhì)量濃度可以顯著升高氧化損傷細胞內(nèi)抗氧化活力。本實驗的研究結(jié)果表明GAT和BCP這兩種萜烯化合物對AAPH誘導的HepG2細胞氧化損傷具有一定的防護作用，除了通過直接清除ROS自由基而發(fā)揮抗氧化作用，還通過影響細胞內(nèi)抗氧化活力而發(fā)揮作用。這一點在很多文獻中亦有分析，黃娜娜[35]研究了柑橘精油對過氧化氫誘導的人皮膚成纖維細胞模型的氧化損傷恢復作用，認為柑橘精油及活性成分能夠使GSH-Px、SOD、CAT的活力明顯提升，揭示了其可能通過增強細胞內(nèi)源性抗氧化酶活力而發(fā)揮保護作用。

2.2.5 萜烯化合物對氧化損傷細胞中GSH濃度的影響

GSH作為細胞內(nèi)重要的非酶系統(tǒng)抗氧化劑，可用作自由基清除劑，通過維持細胞生長的氧化還原穩(wěn)態(tài)而在氧化應激中起關鍵作用[36]，當機體受到氧化應激時，GSH會被氧化成GSSH，因此GSH的濃度變化可用以評估細胞氧化損傷情況[37]。

圖 7 GAT對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)GSH濃度的影響Fig. 7 Effect of GAT on glutathione concentration in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

圖 8 BCP對AAPH氧化應激HepG2細胞內(nèi)GSH濃度的影響Fig. 8 Effect of BCP on GSH concentration in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

細胞在正常狀態(tài)下，GSH濃度較高，未加樣品進行保護，只加AAPH損傷處理的HepG2細胞，與空白組相比顯著下降（P＜0.05），下降率達49.86%，經(jīng)萜烯類化合物預處理后，細胞內(nèi)GSH的濃度顯著增加，且呈濃度依賴性。GAT低質(zhì)量濃度組至高質(zhì)量濃度組GSH濃度增加率分別為22.59%、43.67%、66.50%、83.22%，經(jīng)高質(zhì)量濃度組GAT（0.5 mg/L）處理后的細胞中GSH濃度與空白組仍有顯著性差異，說明此時細胞的氧化損傷并未完全消除。BCP低質(zhì)量濃度組至高質(zhì)量濃度組GSH濃度增加率分別為66.52%、87.08%、99.92%，經(jīng)高質(zhì)量濃度BCP（5 mg/L）處理后的細胞中GSH濃度與空白組無顯著性差異，此時細胞的氧化損傷得到抑制甚至消除。以上結(jié)果表明，經(jīng)GAT和BCP處理后的細胞能夠阻止細胞內(nèi)GSH水平下降，保護細胞免受AAPH誘導的氧化損傷。相似的結(jié)論在其他文獻中也有得出，Ojha等[38]將魚藤酮誘導的帕金森病大鼠模型經(jīng)BCP處理后，不僅能減少促炎性細胞因子和炎性介質(zhì)，還能恢復谷胱甘肽的消耗，這說明BCP因其強大的抗氧化性和抗炎活性能對由魚藤酮誘導的帕金森病提供神經(jīng)保護的作用。目前有研究表明，高質(zhì)量濃度下的BCP和GAT具有一定的抗氧化作用，例如：25 mg/kg BCP可以使多柔比星誘導的慢性心臟毒性大鼠體內(nèi)MDA水平降低，抗氧化酶（SOD、CAT）及GSH活性升高[23]、60 μmol/L GAT具有較強的自由基清除能力[39]。另外，BCP對氧化應激細胞的抗氧化作用可能依賴于大麻素受體2型[40]，GAT在極性溶劑中清除自由基的機制歸因于順序質(zhì)子損失電子轉(zhuǎn)移，與羰基官能團附近的烯丙基和烷基氫的存在有關[39]。與之前研究不同，本實驗選擇與白酒中BCP、GAT的實際質(zhì)量濃度相似的范圍，綜合多種抗氧化作用指標證明了BCP和GAT在白酒劑量水平（低質(zhì)量濃度）下也發(fā)揮著較強的抗氧化作用，為中國白酒的健康發(fā)展提供了理論參考。

3 結(jié) 論

本研究利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對13 種牛欄山二鍋頭酒中的GAT和BCP進行測定，其中GAT在二鍋頭酒中為首次發(fā)現(xiàn)。按酒中劑量范圍利用AAPH誘導的HepG2細胞氧化損傷模型探究抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)GAT和BCP能夠清除氧化損傷細胞內(nèi)ROS、提高機體內(nèi)非酶系統(tǒng)抗氧化劑GSH的濃度，通過提高SOD、GSH-Px、CAT的活性增強細胞內(nèi)酶抗氧化系統(tǒng)，同時還可以防止脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量的增加，提高細胞的抗氧化能力，其抗氧化能力呈濃度依賴性增加。這一結(jié)果可為中國白酒的健康特性提供基礎數(shù)據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)GAT和BCP在牛欄山二鍋頭酒中的劑量下，可發(fā)揮抗氧化作用，而且此劑量水平未超過美國香料生產(chǎn)者協(xié)會的香料限制標準，符合食品安全法規(guī)，是一種有效的白酒抗氧化劑。白酒是中國人的日常飲品，GAT和BCP可能具有協(xié)同抗氧化作用。今后，明晰其來源及代謝途徑，借助微生物調(diào)控的途徑有效提高GAT和BCP在白酒中的含量，可能會更好地發(fā)揮其抗氧化性。本研究僅表明在與白酒含量相同的劑量范圍內(nèi)GAT和BCP單體具有抗氧化作用，但白酒這一復雜混合體系的生理活性及作用劑量還需進一步研究。