解長遠(yuǎn)，王中江，郭增旺，翟宇玉，滕 飛*，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白營養(yǎng)價(jià)值高，有著良好的功能特性[1]。根據(jù)沉降系數(shù)，大豆中的蛋白質(zhì)可分為2S、7S、11S和15S蛋白。7S與11S球蛋白占大豆蛋白質(zhì)量70%左右，對大豆蛋白營養(yǎng)價(jià)值與功能特性的影響起決定作用[2]。11S球蛋白中含有豐富的含硫氨基酸，其含量遠(yuǎn)高于7S球蛋白，人體自身無法合成的蛋氨酸可以通過攝入含硫氨基酸來補(bǔ)充。相較于7S球蛋白，11S球蛋白中的疏水性氨基酸也更多，對其乳化性影響更大[3]。此外，11S球蛋白能促進(jìn)凝膠的形成，對凝膠咀嚼性、硬度和持水性的影響更為明顯[4]。目前，各國學(xué)者對大豆蛋白的功能性質(zhì)研究很多，但對11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系研究卻鮮見報(bào)道。

近年來，通過高壓、空化、射流、高溫等手段對蛋白改性的技術(shù)受到廣泛關(guān)注[5]。呂博等[6-7]發(fā)現(xiàn)利用高壓均質(zhì)可改變大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)，改善蛋白的凝膠特性。李楊等[8]發(fā)現(xiàn)利用超聲形成的空化效應(yīng)可改善大豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。許艷華等[9]研究表明利用微射流技術(shù)可提高大豆蛋白的起泡穩(wěn)定性、溶解度和吸油性。曾劍華等[10]研究表明大豆蛋白的溶解性與乳化性可通過熱處理來改善。射流空化技術(shù)作為一種高新技術(shù)，在食品領(lǐng)域開始受到關(guān)注，射流空化形成的空化效應(yīng)以及在其流道內(nèi)產(chǎn)生的高速湍流剪切、瞬間流道高壓力差、分子對沖撞擊效應(yīng)，使射流空化腔體內(nèi)形成空化場、高壓場、射流場、高溫場等多重物理場效應(yīng)，將超聲、高壓均質(zhì)、射流、熱處理等技術(shù)的優(yōu)勢集為一體[11-14];因此利用射流空化技術(shù)可對大豆蛋白產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊作用，但目前還鮮見應(yīng)用于改性大豆蛋白領(lǐng)域。

本實(shí)驗(yàn)通過分析在不同處理時(shí)間和蛋白質(zhì)量濃度下，射流空化技術(shù)對大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響，探究大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性之間的構(gòu)效關(guān)系，為射流空化技術(shù)在蛋白改性方面的應(yīng)用提供理論參考，并為高功能性大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粉（蛋白干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)55%） 哈高科大豆食品有限責(zé)任公司;8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海譜振生物科技有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS） 北京索萊寶科技有限公司;Lowry法蛋白定量檢測試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司;2,4-二硝基苯肼、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）美國Sigma-Aldrich公司;亞硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C型冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;DFS-Dairy-001型均質(zhì)機(jī) 帝斯曼（中國）有限公司;LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;PALS型激光粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司;F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司;2L實(shí)驗(yàn)室小型射流空化機(jī) 北京中森匯嘉科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 11S球蛋白提取及樣品制備

參考Nagano等[15]的方法，脫脂大豆粉與去離子水以料液比1∶15混合，用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至7.5，攪拌1 h后10 000 r/min離心15 min，取上清液加入亞硫酸鈉使其終質(zhì)量濃度為0.98 g/L，攪拌1 h后用鹽酸溶液將pH值調(diào)至6.4，于4 ℃環(huán)境下靜置過夜，12 000 r/min離心20 min，將所得沉淀物冷凍干燥，所得即為大豆11S球蛋白（純度為93.27%）。

用超純水配制質(zhì)量濃度分別為2 g/100 mL與5 g/100 mL的大豆11S球蛋白溶液，用1 mol/L鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液將溶液pH值調(diào)至7.0后，置于射流空化機(jī)內(nèi)處理0、2、4、6、8、10、15、20 min后，冷凍干燥得大豆11S球蛋白樣品。

1.3.2 熒光光譜測定

參照王中江等[16]的方法。將蛋白樣品溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的蛋白溶液，測定條件為激發(fā)光譜290 nm，發(fā)射波長300～450 nm，夾縫寬度均為5.0 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜測定

參照Surewicz等[17]的方法。稱取樣品2 mg，加入100 mg溴化鉀，壓片后測定。測定條件：環(huán)境溫度25 ℃，掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64 次。

1.3.4 表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法[18]。將蛋白樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白溶液，充分混合后10 000 r/min離心30 min，用相同濃度的磷酸鹽緩沖液，稀釋上清液至質(zhì)量濃度為0.07～0.67 mg/mL（用Lowry法測定溶液中蛋白質(zhì)量濃度[19]）。取不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液4 mL，加入40 μL 8 mmol/L ANS溶液，混勻后靜置3 min，測定樣品的熒光強(qiáng)度。測定條件為激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長490 nm，夾縫寬度均為5 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)量濃度作曲線，曲線的初始斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.3.5 巰基和二硫鍵含量的測定

參考Shimada等[20]的方法。游離巰基含量：用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將樣品配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液，取2 mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、4 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，pH 8.0）中，再加入0.10 mL 0.01 mol/L Ellman試劑，混勻后在25 ℃下反應(yīng)15 min，測定其在412 nm波長處的吸光度。總巰基含量：取2 mL 20 mg/mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-Gly緩沖液（含8 mol/L尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% SDS），再加入0.10 mL 0.01 mol/L Ellman試劑，混勻后在25℃下反應(yīng)15 min，測定其在412 nm波長處的吸光度。兩種測定方法均以不加Ellman試劑的溶液作為空白對照。巰基與二硫鍵含量分別按式（1）、（2）計(jì)算。

式中：1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））;A412nm為樣品溶液在412 nm波長處的吸光度;n為稀釋倍數(shù);ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 羰基含量測定

參考Lertittikul等[21]的方法。取0.2 mL 5 mg/mL蛋白溶液，加入0.5 mL含10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液（2 mol/L）混合，于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h。在各樣品中加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的三氯乙酸溶液，混勻后靜置10 min，10 000 r/min離心20 min，所得沉淀用1 mL的乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌3 次，將蛋白懸浮于0.6 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，于37 ℃水浴鍋中保溫30 min。以不含2,4-二硝基苯肼的溶液為空白對照，用分光光度計(jì)測定其在350～390 nm范圍內(nèi)的最大吸光度，摩爾消光系數(shù)為22 000/（L/（mol·cm）），用最大吸光度計(jì)算羰基含量，以每克蛋白質(zhì)所含羰基物質(zhì)的量表示（μmol/g）。

1.3.7 溶解度測定

將蛋白樣品溶于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液，攪拌1 h后于12 000 r/min下離心20 min，上清液經(jīng)適度稀釋后，采用Lowry法測定其蛋白質(zhì)量[19]。溶解度按式（3）計(jì)算。

1.3.8 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照Tang等[22]的方法。將蛋白樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，與大豆油以體積比3∶1混合，以10 000 r/min乳化1 min后，取50 μL加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% SDS溶液中混勻。在500 nm波長處分別測定0 min和30 min時(shí)乳液的吸光度。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）分別按式（4）、（5）計(jì)算。

式中：T為反應(yīng)速率常數(shù)（2.303）;A0為0 min時(shí)乳液吸光度;A30為靜止30 min后的乳液吸光度;n為稀釋倍數(shù)（100）;ρ為乳化液形成前蛋白水溶液中的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）;φ為乳化液中油體積分?jǐn)?shù)/%。

1.3.9 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

參考Watanabe等[23]的方法，將100 mL 1 g/100 mL的蛋白溶液以17 500 r/min均質(zhì)2 min，記錄均質(zhì)后泡沫體積與靜置30 min后泡沫體積。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別按式（6）、（7）計(jì)算。

式中：V0為均質(zhì)后泡沫體積/mL;V1為蛋白溶液體積（100 mL）;V30為靜置30 min后泡沫體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用OriginPro 8.5軟件制圖，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析和方差分析，P＜0.05為差異顯著。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白的最大吸收波長與熒光強(qiáng)度的影響

表 1 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白的最大吸收波長（λmax）與熒光強(qiáng)度的影響Table 1 Effect of jet cavitation treatment time on maximum absorption wavelength (λmax) and fluorescence intensity of 11S globulin at different concentrations

如表1所示，隨著射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白的熒光λmax均呈先紅移后藍(lán)移的趨勢，熒光強(qiáng)度呈先升高后降低的趨勢，且在處理時(shí)間為6 min時(shí)紅移距離和熒光強(qiáng)度均達(dá)到最大;在不同射流空化處理時(shí)間下，5 g/100 mL大豆11S球蛋白λmax均大于2 g/100 mL。這可能是因?yàn)殡S著處理時(shí)間的延長，射流空化產(chǎn)生的高速湍流剪切、分子對沖撞擊效應(yīng)以及流道內(nèi)部的高壓力差，使蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸展開，部分處于分子內(nèi)部疏水環(huán)境的色氨酸殘基暴露在外部親水環(huán)境中，使熒光強(qiáng)度增大并出現(xiàn)λmax紅移現(xiàn)象[24]。但繼續(xù)延長處理時(shí)間，大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開，蛋白分子間的次級鍵、共價(jià)鍵以及疏水相互作用等使蛋白發(fā)生聚集，部分色氨酸殘基被包埋，生色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中，使熒光強(qiáng)度下降，λmax藍(lán)移。而5 g/100 mL大豆11S球蛋白的亞基或多肽鏈之間相互接觸機(jī)率比2 g/100 mL時(shí)大，高質(zhì)量濃度的蛋白溶液更易在射流空化腔體內(nèi)發(fā)生有效碰撞，使5 g/100 mL大豆11S球蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露程度更大，并隨著處理時(shí)間的延長，聚集也更加明顯。這表明射流空化技術(shù)可以調(diào)控蛋白分子的解聚和聚集，且與射流空化處理時(shí)間及蛋白質(zhì)量濃度有關(guān)。

2.2 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖 1 射流空化處理時(shí)間對2 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure of 2 g/100 mL 11S globulin

圖 2 射流空化處理時(shí)間對5 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure of 5 g/100 mL 11S globulin

表 2 射流空化處理時(shí)間對2 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 2 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure content of 2 g/100 mL 11S globulin

表 3 射流空化處理時(shí)間對5 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 3 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure content of 5 g/100 mL 11S globulin

對傅里葉變換紅外光譜圖（圖1、2）中的酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）進(jìn)行去卷積、二階導(dǎo)數(shù)以及擬合處理，定量分析大豆11S球蛋白中的二級結(jié)構(gòu)含量，其結(jié)果如表2、3所示。隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律為α-螺旋相對含量呈先下降后上升趨勢，β-折疊相對含量整體呈下降趨勢，β-轉(zhuǎn)角相對含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量變化不明顯;5 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律為α-螺旋相對含量呈先下降后上升趨勢，β-折疊與β-轉(zhuǎn)角相對含量整體均呈下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量呈上升趨勢。這可能是由于在射流空化處理下，射流空化腔體內(nèi)的高剪切力、高壓力差以及空化效應(yīng)等導(dǎo)致蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。由于α-螺旋與β-折疊相較于β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)卷曲呈現(xiàn)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[25]，由此可以推測11S球蛋白在射流空化技術(shù)的處理下，結(jié)構(gòu)逐漸展開，分子間作用力受到破壞，從有序的結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦邮杷傻臓顟B(tài)，無序結(jié)構(gòu)增加，蛋白發(fā)生了解聚行為。5 g/100 mL大豆11S球蛋白的無規(guī)卷曲相對含量在射流空化處理下顯著升高（P＜0.05），由此可知高質(zhì)量濃度的蛋白溶液經(jīng)射流空化處理后，蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加疏松，這是由于高質(zhì)量濃度蛋白溶液中蛋白分子之間的相互碰撞更劇烈，射流空化腔體內(nèi)的極端環(huán)境使蛋白結(jié)構(gòu)的打開程度更大，產(chǎn)生了更多的無序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白的二級結(jié)構(gòu)在射流空化處理下出現(xiàn)差異。這表明射流空化技術(shù)可以改變大豆11S球蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

2.3 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白表面疏水性的影響

圖 3 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of jet cavitation treatment time on hydrophobicity of 11S globulin at different concentrations

如圖3所示，隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白表面疏水性均呈先升高后降低的趨勢，且在處理時(shí)間為6 min時(shí)表面疏水性達(dá)到最高。這可能是因?yàn)殡S射流空化處理時(shí)間的延長，11S球蛋白受射流空化腔體內(nèi)的空化場、射流場、高壓場、高溫場等多重物理場的作用，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)打開，內(nèi)部包裹的疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性提高;隨著射流空化處理時(shí)間的進(jìn)一步延長，11S球蛋白在疏水相互作用下重新聚集，疏水基團(tuán)的掩埋使蛋白的表面疏水性下降[26]。這與熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜的分析結(jié)果一致。而5 g/100 mL大豆11S球蛋白亞基或多肽鏈之間的有效碰撞比2 g/100 mL大豆11S球蛋白多，使高質(zhì)量濃度的蛋白溶液在射流空化處理過程中，蛋白內(nèi)部疏水區(qū)域的暴露程度更大，導(dǎo)致表面疏水性更高，使不同質(zhì)量濃度11S球蛋白的表面疏水性在射流空化處理下存在差異。這表明射流空化技術(shù)可以通過改變處理時(shí)間與蛋白質(zhì)量濃度影響大豆11S球蛋白的表面疏水性。

2.4 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白羰基含量的影響

圖 4 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白羰基含量的影響Fig. 4 Effect of jet cavitation treatment time on carbonyl content of 11S globulin at different concentrations

羰基含量的變化可反映出蛋白結(jié)構(gòu)中的羰基以及易被外界環(huán)境氧化成羰基的氨基酸側(cè)鏈（精氨酸、脯氨酸與賴氨酸等）的包埋和暴露情況[27]。因此，羰基含量可以反映蛋白的氧化程度和蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化。如圖4所示，隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白羰基含量呈先上升后下降趨勢。這可能是在射流空化處理初期，腔體內(nèi)的高溫、高壓力、高剪切力等極端環(huán)境使蛋白分子內(nèi)部的羰基，以及易被氧化生成羰基的氨基酸側(cè)鏈暴露，使羰基含量升高;延長處理時(shí)間，蛋白發(fā)生聚集，11S球蛋白的羰基與氨基酸側(cè)鏈被包埋，羰基含量下降。這表明射流空化處理可使11S球蛋白的結(jié)構(gòu)展開，其羰基以及易被氧化成羰基的氨基酸側(cè)鏈暴露。由于蛋白質(zhì)量濃度高，在射流空化處理過程中分子之間碰撞的機(jī)率更大，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的展開程度更大，使更多的羰基暴露出來，隨著處理時(shí)間的延長，已暴露的疏水基團(tuán)使蛋白更易發(fā)生聚集，而這種聚集作用將蛋白分子的羰基與已被氧化成羰基的氨基酸側(cè)鏈包埋在聚集體內(nèi)部，導(dǎo)致在不同處理時(shí)間和不同質(zhì)量濃度下大豆11S球蛋白的羰基含量存在差異。

2.5 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響

蛋白中巰基含量對其結(jié)構(gòu)的影響較大，巰基形成的二硫鍵是維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵。如圖5、6所示，隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白中游離巰基含量呈先上升后下降的趨勢，二硫鍵含量呈先下降后上升的趨勢，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白經(jīng)射流空化處理后的游離巰基含量比2 g/100 mL大豆11S球蛋白高，二硫鍵含量比2 g/100 mL大豆11S球蛋白低。這表明射流空化產(chǎn)生的空化效應(yīng)、高速剪切以及湍流作用使11S球蛋白分子伸展，維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的二硫鍵斷裂，內(nèi)部巰基暴露到蛋白分子表面，游離巰基的含量升高使蛋白表面疏水性升高，提高了蛋白的表面活性，使蛋白的乳化特性與起泡特性得到改善;繼續(xù)射流空化處理，蛋白發(fā)生聚集，蛋白分子暴露的游離巰基形成了二硫鍵[28]。高質(zhì)量濃度11S球蛋白溶液在射流空化腔體內(nèi)發(fā)生有效碰撞的機(jī)率高，在射流空化處理下，高質(zhì)量濃度蛋白溶液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露程度更大，因此經(jīng)射流空化處理后的5 g/100 mL大豆11S球蛋白的游離巰基含量更高，二硫鍵含量更低。

圖 5 射流空化處理時(shí)間對2 g/100 mL大豆11S球蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig. 5 Effect of jet cavitation treatment time on the contents of free sulfhydryl groups and disulfide bonds in 2 g/100 mL 11S globulin

圖 6 射流空化處理時(shí)間對5 g/100 mL大豆11S球蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig. 6 Effect of jet cavitation treatment time on the contents of free sulfhydryl groups and disulfide bonds in 5 g/100 mL 11S globulin

2.6 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度11S球蛋白溶解度的影響

如圖7所示，隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白溶解度呈先升高后下降的趨勢，在處理時(shí)間為4 min時(shí)溶解度達(dá)到最大，且此時(shí)5 g/100 mL大豆11S球蛋白的溶解度高于2 g/100 mL大豆11S球蛋白，隨著處理時(shí)間的延長，溶解度略有下降，處理8～20 min時(shí)，2 g/100 mL大豆11S球蛋白的溶解度高于5 g/100 mL大豆11S球蛋白。蛋白的溶解度與其二級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)打開程度、親水基團(tuán)暴露和分子間作用力有關(guān)。Zhao Yingying等[29]研究表明，蛋白中α-螺旋含量的減少可能導(dǎo)致分子間的相互作用發(fā)生變化，使蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序的狀態(tài)，提高其溶解性;任為聰?shù)萚30]認(rèn)為超聲空化效應(yīng)提高了蛋白質(zhì)溶解性，可能是由于空化作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，肽鍵斷裂，蛋白分子質(zhì)量減小，更多的親水性氨基酸處于外層;Chanasattru等[31]研究表明，空化效應(yīng)可使球狀蛋白分子之間的相互作用力下降，使蛋白質(zhì)在溶劑中的可壓縮性增強(qiáng)，從而更易分散在溶劑中，增強(qiáng)其溶解性。這和本實(shí)驗(yàn)上述蛋白結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致。這表明適當(dāng)?shù)纳淞骺栈幚砜梢愿淖兊鞍椎亩壗Y(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白的無序結(jié)構(gòu)增多和親水基團(tuán)相對增多，增強(qiáng)了蛋白與水的親和力，并降低了球狀蛋白分子之間的相互作用力，使蛋白更易分散在溶劑中，進(jìn)而使蛋白的溶解性得到改善。但在長時(shí)間射流空化處理下腔體內(nèi)的剪切和撞擊作用增強(qiáng)了蛋白之間產(chǎn)生的分子間作用力，使蛋白發(fā)生聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致蛋白的溶解度下降。由熒光光譜分析結(jié)果可知，在射流空化處理時(shí)間為4 min時(shí)，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的展開程度比2 g/100 mL大豆11S球蛋白更大，與水的接觸面積也更大，使其溶解度更高，隨著處理時(shí)間的延長，11S球蛋白的聚集降低了其水合作用，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白更容易發(fā)生聚集，蛋白的水合作用降低程度也更大，因此在處理末期，2 g/100 mL大豆11S球蛋白表現(xiàn)出更好的溶解度。

圖 7 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度11S球蛋白溶解度的影響Fig. 7 Effect of jet cavitation treatment time on solubility of 11S globulin at different concentrations

2.7 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白乳化特性的影響

圖 8 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白EAI（A）和ESI（B）的影響Fig. 8 Effect of jet cavitation treatment time on emulsifying ability index (A)and emulsion stability index (B) of 11S globulin at different concentrations

由圖8可知，隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白EAI與ESI均呈先升高后下降的趨勢，在處理6 min時(shí)達(dá)到最大，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白EAI與ESI均高于2 g/100 mL大豆11S球蛋白。研究表明，蛋白的乳化特性與其聚集狀態(tài)、表面疏水性以及巰基含量有關(guān);蛋白的解聚與二硫鍵的斷裂導(dǎo)致游離巰基含量升高，表面疏水性提高，使蛋白分子向油-水界面移動(dòng)與重排的速率加快，提高了蛋白質(zhì)的界面活性[32-33]。這與上述熒光光譜、表面疏水性以及巰基含量的分析結(jié)果一致。這表明射流空化處理使蛋白發(fā)生解折疊行為，游離巰基含量升高，進(jìn)而提高其表面疏水性，使蛋白在油-水界面更好地展開，改善其乳化特性。但處理時(shí)間進(jìn)一步延長，蛋白之間產(chǎn)生分子間作用力，熒光光譜中λmax發(fā)生藍(lán)移，二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋相對含量上升，β-轉(zhuǎn)角相對含量下降，游離巰基交聯(lián)形成二硫鍵，處理末期蛋白發(fā)生聚集，疏水基團(tuán)內(nèi)卷，其EAI和ESI也隨之下降。射流空化處理過程中，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的乳化特性始終優(yōu)于2 g/100 mL大豆11S球蛋白，這是由于蛋白質(zhì)的乳化特性主要與其表面疏水性有關(guān)[34]。上述結(jié)果表明，經(jīng)射流空化處理大豆11S球蛋白，高質(zhì)量濃度蛋白溶液的表面疏水性更高，導(dǎo)致5 g/100 mL 11S球蛋白的EAI及ESI均高于2 g/100 mL 11S球蛋白。

2.8 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白起泡特性的影響

由圖9可知，隨射流空化處理時(shí)間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白起泡性呈先升高后下降的趨勢，且在處理6 min時(shí)起泡性達(dá)到最高，兩種質(zhì)量濃度11S球蛋白的泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。蛋白質(zhì)的起泡性與其巰基含量、兩親性以及蛋白的聚集狀態(tài)有關(guān)。蛋白中游離巰基含量的增加使其表面疏水性增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白在氣-液界面的表面張力降低，且蛋白分子的展開促進(jìn)了蛋白在氣-液界面重排，形成具有黏彈性的薄膜，進(jìn)而改善了蛋白的起泡性[35-36]。由上述結(jié)果可知，射流空化處理可使蛋白中二硫鍵斷裂，游離巰基含量上升，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露在分子表面，使蛋白分子在氣-液界面的定向排列更加有序;由熒光光譜與傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果可知，射流空化使蛋白發(fā)生解聚，從有序的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邮杷傻臓顟B(tài)，伸展的蛋白分子間相互作用形成更穩(wěn)定的二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜，使泡沫更好地形成并進(jìn)一步穩(wěn)定[37-38]。延長射流空化處理時(shí)間，大豆11S球蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，射流空化的過度處理使蛋白發(fā)生聚集，導(dǎo)致蛋白移動(dòng)到氣-液界面的遷移速率降低，造成了起泡性降低。

圖 9 射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 9 Effect of jet cavitation treatment time on foaming capacity (A)and foam stability (B) of 11S globulin at different concentrations

在射流空化處理過程中，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白泡沫穩(wěn)定性呈逐漸升高的趨勢，可能是由于射流空化的高強(qiáng)度處理使其結(jié)構(gòu)更具柔性，阻止了泡沫的破裂。有研究表明，在高壓環(huán)境下，肽鏈可形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠有效地提高泡沫穩(wěn)定性[39]。隨處理時(shí)間的延長，蛋白逐漸聚集，內(nèi)部疏水基團(tuán)內(nèi)卷，降低了表面張力，起泡性下降，但泡沫穩(wěn)定性幾乎不變。熒光光譜分析結(jié)果表明，在射流空化處理末期蛋白的λmax發(fā)生藍(lán)移，蛋白發(fā)生聚集，提高了其黏性和柔韌性，形成的氣-液界面更致密，可有效防止因外部形變而導(dǎo)致界面膜破裂的現(xiàn)象，提高泡沫穩(wěn)定性。Guo Fengxian等[40]的研究也發(fā)現(xiàn)了蛋白聚集體能夠提高蛋白的泡沫穩(wěn)定性。

在射流空化處理過程中，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性總體高于2 g/100 mL，這可能是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度蛋白的亞基或多肽鏈之間相互接觸機(jī)率更大，更易在射流空化腔體內(nèi)發(fā)生有效碰撞，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的打開程度更大，表面張力的降低使其更易在溶液界面相互作用成膜;延長處理時(shí)間，蛋白遷移到氣-液界面的速率降低，起泡性下降，而蛋白的聚集現(xiàn)象使蛋白在氣-液界面形成致密的界面膜，導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性升高，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的聚集更加明顯，因此，不同質(zhì)量濃度11S球蛋白的起泡特性在射流空化處理下出現(xiàn)了差異。

3 結(jié) 論

以大豆11S球蛋白為研究對象，探究不同射流空化處理時(shí)間對不同質(zhì)量濃度的大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響。熒光光譜結(jié)果表明，2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白的熒光λmax呈先紅移后藍(lán)移的趨勢，熒光強(qiáng)度呈先升高后降低的趨勢，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白λmax均大于2 g/100 mL;傅里葉變換紅外光譜分析表明，2 g/100 mL大豆11S球蛋白的α-螺旋相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢、β-折疊相對含量呈現(xiàn)下降趨勢，β-轉(zhuǎn)角相對含量呈先上升后下降的趨勢，無規(guī)卷曲相對含量變化不明顯;5 g/100 mL大豆11S球蛋白的α-螺旋相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢、β-折疊與β-轉(zhuǎn)角相對含量呈下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白表面疏水性、羰基與游離巰基含量均呈先升高后下降的趨勢，二硫鍵含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;以上結(jié)果表明，射流空化可使蛋白結(jié)構(gòu)展開，延長處理時(shí)間，蛋白逐漸聚集，質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的大豆11S球蛋白與2 g/100 mL相比，暴露程度更大，在蛋白發(fā)生聚集時(shí)也更加明顯。射流空化處理后2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白的溶解度、乳化特性與起泡特性均得到明顯改善，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白的功能特性更佳，本實(shí)驗(yàn)為深入了解射流空化改性大豆蛋白的作用機(jī)理提供了理論依據(jù)和參考。