王勝男，曲丹妮，邵國強(qiáng)，楊晉杰，趙賀開，楊立娜，李 君，何余堂，劉 賀,*，朱丹實(shí),*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013;2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

大豆種皮來源于大豆制品加工的副產(chǎn)物，多用作飼料[1]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆種皮中含有果膠、纖維素及半纖維素等物質(zhì)，可作為提取多糖的原料[1-2]。此外，大豆種皮多糖是一種天然活性物質(zhì)，具有多種功能特性，如抗氧化、乳化性等，因此在食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。然而，傳統(tǒng)提取方法存在得率低、費(fèi)時(shí)等弊端，而超聲、微波等技術(shù)不僅可以改進(jìn)以上弊端，還可以提高多糖的功能特性。

目前，超聲波、微波技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品中功能成分的提取[3]。超聲波提取多糖是利用超聲波的空化及剪切等作用，使提取劑易于進(jìn)入多糖分子內(nèi)部，從而提高提取率[4]。王萍等[5]探究超聲提取滑菇多糖，發(fā)現(xiàn)超聲可縮短提取時(shí)間并提高得率，但超聲時(shí)間過長，容易引起多糖支鏈斷裂。Ji Lei等[6]發(fā)現(xiàn)微波產(chǎn)熱作用使細(xì)胞內(nèi)部膨脹破裂，進(jìn)而導(dǎo)致提取劑進(jìn)入分子內(nèi)部結(jié)合多糖，提高提取率。采用超聲波、微波提取多糖，不僅省時(shí)、得率高，還可優(yōu)化多糖性質(zhì)。張帥等[7]通過實(shí)驗(yàn)證明超聲、微波提取技術(shù)可提高多糖的抗氧化作用。本課題組前期也證明采用微波處理可以有效提高大豆種皮多糖的乳化性[8]。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波通過破壞多糖分子間氫鍵，進(jìn)而破壞多糖的螺旋構(gòu)象，從而減弱多糖的水溶性和吸濕性。Chikari等[10]的研究表明，微波可使多糖的鏈構(gòu)象形成更均勻分布的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)多糖溶液的穩(wěn)定性。目前，通過物理、化學(xué)等方法改性多糖從而開發(fā)各類功能性食品是研究熱點(diǎn)[11]。然而，關(guān)于超聲波和微波協(xié)同提取多糖的研究不夠深入，對(duì)多糖性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的影響鮮被揭示。因此，本實(shí)驗(yàn)通過測定大豆種皮多糖的總糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、分子質(zhì)量、單糖組成，分析傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡結(jié)果，探究超聲-微波協(xié)同技術(shù)對(duì)大豆種皮多糖性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，為后續(xù)多糖結(jié)構(gòu)的研究及超聲-微波協(xié)同技術(shù)的應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆皮（‘黑河43’）購于遼寧錦州大豆皮經(jīng)銷公司，其中蛋白質(zhì)、纖維素和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%、34%和14%。鹽酸、草酸銨、乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UWave-2000型多功能微波合成萃取儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;FW-100型高速萬能粉碎機(jī) 北京市永明醫(yī)療儀器廠;FA1004型電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;PHS-3CW型pH計(jì) 上海般特儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;JB-2A恒溫磁力攪拌器 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HH-S2S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 鄄城威瑞科教儀器有限公司;IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司;L5紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司;XE-70原子力顯微鏡 韓國Park Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆種皮多糖提取

超聲-微波聯(lián)用法：將大豆種皮除雜、粉碎、過60 目篩后，與體積分?jǐn)?shù)1%乙醇溶液按照體積比1∶10混合，磁力攪拌30 min脫色后，置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干;準(zhǔn)確稱取烘干后的大豆種皮，按照料液比1∶20加入0.6 g/100 mL草酸銨，在超聲功率480 W，微波功率480 W條件下，處理15 min[12]，冷卻后過濾，上清液在4 000 r/min的條件下離心10 min，離心后上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積1/3，用2 mol/L的稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，緩慢加入雙倍體積無水乙醇并不斷攪拌使其醇沉，4 ℃下放置12 h后，于65 ℃恒溫干燥箱烘干[13]，得到超聲-微波提取的粗多糖（soy hull polysaccharides obtained by ultrasonicmicrowave extraction，UMSHP）。

超聲法：大豆種皮前處理同超聲-微波聯(lián)用法，超聲波480 W，超聲時(shí)間15 min[14]，不進(jìn)行微波處理，后續(xù)步驟同超聲-微波聯(lián)用法，得到超聲提取的粗多糖（soy hull polysaccharides obtained by ultrasonic extraction，USHP）。

微波法：大豆種皮前處理同超聲-微波聯(lián)用法，不進(jìn)行超聲波處理，在微波480 W條件下，處理15 min[12]，后續(xù)步驟同超聲-微波聯(lián)用法，得到微波提取的粗多糖（soy hull polysaccharides obtained by microwave extraction，MSHP）。

1.3.2 總糖及蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用苯酚-硫酸法[15]，葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，在490 nm波長處測定吸光度?？偺琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.006 7x-0.016 2（R2=0.997 7）。

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用BCA試劑盒比色法[16]，在562 nm波長處測定吸光度。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.004 22x-0.021 24（R2=0.998 7）。

1.3.3 分子質(zhì)量測定

通過高效凝膠滲透色譜法測定USHP、MSHP和UMSHP的分子質(zhì)量。USHP、MSHP和UMSHP（20 mg）溶解于2 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液中，并以15 000 r/min離心10 min。將20 μL溶液通過0.22 μm過濾器過濾，然后注入U(xiǎn)ltrahydrogel? Linear柱（300 mm×7.8 mm，2 mm）中。流速：0.9 mL/min;柱溫：45 ℃;使用分子質(zhì)量分別為1.338×105、4.11×104、2.5×103Da和1×103Da的DextranT系列標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)色譜柱并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。

1.3.4 單糖組成測定

將5 mg USHP、MSHP和UMSHP分別溶解于10 mL的三氟乙酸（4 mol/L）中，在100～110 ℃下水解6 h，在水解產(chǎn)物中多次加入甲醇，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除甲醇，用氮吹儀吹干水解產(chǎn)物，最后用去離子水稀釋20 倍，利用高效離子色譜分析單糖組成[18]。色譜柱為：Carbopac P A20 column （150 mm×3 mm）;流速：0.5 mL/min;進(jìn)樣量：25 μL;檢測器：脈沖安培檢測器;前30 min使用4 mmol/L NaOH溶液洗脫，之后采用濃度為16 mmol/L的NaOH溶液洗脫。單糖組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖 1 單糖組成高效離子色譜圖Fig. 1 High performance ion chromatogram of mixed monosaccharide standards

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

將USHP、MSHP和UMSHP分別和KBr按一定比例混合研磨，利用壓片機(jī)壓片。測試樣品前進(jìn)行背景掃描去除干擾因素，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行空白掃描[17]。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

取粉碎后的USHP、MSHP和UMSHP樣品各1 mg，分別粘在掃描電子顯微鏡的樣品盤上，用吹塵球吹掉多余樣品，然后噴金15 min，在電壓為0.5～30 kV下分別放大400、10 000 倍觀察樣品表觀形態(tài)。

1.3.7 原子力顯微鏡觀察

將USHP、MSHP和UMSHP樣品與去離子水混合，配制成5 mg/mL多糖溶液，待多糖全部溶解后，取5 μL多糖溶液滴在新剝離的云母片上，室溫條件下干燥后，利用原子力顯微鏡觀察多糖分子構(gòu)象（圖片視野為5 μm×5 μm）[19-20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件制圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（單因素方差分析），以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及分子質(zhì)量

表 1 USHP、MSHP和UMSHP的總糖、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及分子質(zhì)量Table 1 Total sugar and protein contents, monosaccharide compositions and molecular masses of USHP, MSHP and UMSHP

圖 2 USHP、MSHP和UMSHP的分子質(zhì)量Fig. 2 Molecular mass determination of USHP, MSHP and UMSHP

USHP、MSHP和UMSHP的總糖、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及分子質(zhì)量結(jié)果見表1及圖2。由表1及圖2可知，UMSHP中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，可達(dá)（50.67±3.36）%，其次是MSHP，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（44.06±2.11）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少的是USHP，為（38.24±2.33）%。USHP、MSHP和UMSHP的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異（P＜0.05），UMSHP蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少，為（2.83±0.15）%。上述結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同作用有助于提高多糖中的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)并降低蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。研究結(jié)果表明，MSHP的重均分子質(zhì)量最大，達(dá)374.41 kDa;其次是UMSHP，為280.27 kDa;最小的是USHP，為187.49 kDa。其中，MSHP的多分散性最高，達(dá)0.755;最低的是UMSHP，為0.528。因此，超聲-微波協(xié)同作用有利于提高多糖分子均一性。Zhu Jiangxiong等[18]研究表明超聲、微波等不同方法提取的富硒茶多糖，導(dǎo)致其多糖的不同組分間含量存在顯著差異，與本研究結(jié)果相似。

2.2 單糖組成

USHP、MSHP和UMSHP的單糖組成見表2及圖3。3 種多糖均含有巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。其中，半乳糖、甘露糖、半乳糖醛酸和鼠李糖總含量分別占USHP、MSHP和UMSHP的86.05%、87.76%和88.27%。USHP中單糖含量最高的是甘露糖，占29.06%，其次是半乳糖，占28.39%。MSHP中單糖含量最高的為半乳糖醛酸，占27.26%。其次是半乳糖，占23.08%。UMSHP中單糖含量最高的是甘露糖，占26.10%，其次是半乳糖醛酸，占25.89%，與甘露糖含量相近。Porfiri等[21]研究表明通過酸法提取的大豆種皮多糖主要由半乳糖和甘露糖組成，其比例分別為23.40%和23.10%，與本研究結(jié)果存在差異。上述結(jié)果表明，超聲-微波協(xié)同作用對(duì)大豆種皮多糖的單糖種類無明顯影響，但對(duì)單糖比例有明顯影響。

表 2 USHP、MSHP和UMSHP的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of USHP, MSHP and UMSHP

圖 3 USHP、MSHP和UMSHP的單糖組成Fig. 3 Chromatograms showing monosaccharide compositions of USHP, MSHP and UMSHP

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

USHP、MSHP和UMSHP的傅里葉變換紅外光譜見圖4。USHP與MSHP的圖譜相似，在3 250～3 050 cm-1范圍內(nèi)的兩個(gè)C—H伸縮振動(dòng)吸收峰均強(qiáng)于UMSHP，且MSHP在該處的峰強(qiáng)度最高。說明USHP和MSHP的不飽和度高于UMSHP，有可能含有烯烴、炔烴或者芳香化合物，也表明USHP和MSHP的羥基數(shù)量較UMSHP多[22]。在2 200～2 000 cm-1出現(xiàn)吸收峰，推斷存在炔烴，且根據(jù)峰強(qiáng)度判斷UMSHP炔烴含量低。由此推測超聲-微波協(xié)同作用引起了不飽和鍵斷裂。3 種多糖在1 600、1 450 cm-1均出現(xiàn)兩處強(qiáng)峰，分別是C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和C—O伸縮振動(dòng)[23]。3 種多糖在1 300～1 320 cm-1存在O—H變角振動(dòng)，在1 400～1 000 cm-1附近存在3 個(gè)C—O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的特征吸收峰，推斷有醚鍵存在于多糖化合物中。此外，在1 230 cm-1附近僅UMSHP存在O—H變角振動(dòng)，該吸收峰是羧基的特征吸收峰，原因可能是超聲-微波協(xié)同改變多糖支鏈位置。根據(jù)889 cm-1附近出現(xiàn)的特征吸收峰，判斷3 種多糖均為β-D型甘露吡喃糖[24]。Yin Chaomin等[25]通過研究也證明超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)未改變糖環(huán)類型。在720 cm-1附近UMSHP較USHP和MSHP少一個(gè)C—H面外彎曲振動(dòng)吸收峰。原因可能是超聲-微波協(xié)同可以改變?nèi)〈奈恢眉爸ф湹膫€(gè)數(shù)，進(jìn)而影響多糖的鏈結(jié)構(gòu)[22]。這些結(jié)果表明USHP、MSHP和UMSHP是具有羥基、炔基、烷基、醚鍵和β-D吡喃葡萄糖環(huán)的果膠類多糖。

圖 4 USHP、MSHP和UMSHP傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of USHP, MSHP and UMSHP

2.4 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖 5 USHP、MSHP和UMSHP 3 種多糖的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 SEM images of USHP, MSHP and UMSHP

由圖5A1、A2可知，USHP表面結(jié)構(gòu)疏松粗糙，呈不規(guī)則塊狀，表現(xiàn)為層層疊加的狀態(tài)，原因可能是超聲波的空化作用使多糖內(nèi)部的氫鍵斷裂[25];MSHP是表面致密但略有碎屑物的片狀結(jié)構(gòu)（圖5B1、B2），原因可能是微波作用促使多糖分子間氫鍵結(jié)合。然而，從圖5C2觀察可知，UMSHP的表面疏松但呈有序的葉片狀結(jié)構(gòu)，與其他兩種多糖差異顯著。3 種多糖微觀結(jié)構(gòu)的差異產(chǎn)生原因可能是超聲-微波協(xié)同作用使多糖分子間排列方式和分子內(nèi)氫鍵強(qiáng)度發(fā)生變化[23,26]。此外，由圖5C1、C2可知，超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取的多糖表面出現(xiàn)了較大孔洞，而USHP和MSHP卻沒有此微觀結(jié)構(gòu)，Wang Yonggang等[27]研究超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取甘草多糖也發(fā)現(xiàn)，多糖表面是粗糙且具有孔狀的結(jié)構(gòu)，分析此現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是超聲-微波協(xié)同技術(shù)使多糖分子間的排斥作用增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，利用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取的多糖微觀結(jié)構(gòu)與以往研究提取的多糖具有顯著差異，因此，本實(shí)驗(yàn)豐富了多糖的種類，有助于下一步深入解析多糖結(jié)構(gòu)。

2.5 原子力顯微鏡觀察結(jié)果

圖 6 USHP、MSHP和UMSHP的原子力顯微鏡圖Fig. 6 AFM images of USHP, MSHP and UMSHP

利用原子力顯微鏡觀察USHP、MSHP、UMSHP的分子構(gòu)象，如圖6所示。從圖6A中可以看出，USHP多糖呈疏松的蠕蟲狀結(jié)構(gòu)，造成此現(xiàn)象的原因可能是超聲波的彌散作用。從圖6B可觀察到MSHP多糖呈致密的線狀結(jié)構(gòu)，還附著許多由多糖支鏈纏繞形成大小不一的球狀體，原因可能是糖醛酸中羧基或者羧基中氧原子與多糖鏈中氫原子結(jié)合形成氫鍵[20,28]。圖6C表征的是UMSHP的鏈狀結(jié)構(gòu)，觀察到UMSHP主要由直徑較大的球形顆粒及疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，但多糖分子聚集情況明顯，原因可能是超聲-微波協(xié)同作用可促進(jìn)大豆種皮多糖分子聚集并抑制糖醛酸中羧基的氧原子與糖鏈中氫原子結(jié)合形成的氫鍵。Shan等[29]利用超聲-微波從柚子皮中提取果膠，研究發(fā)現(xiàn)超聲-微波提取的柚子皮多糖較單一提取方法的結(jié)構(gòu)疏松，與本研究結(jié)果相似。此外，多糖分子鏈的靈活性與多糖分支和不同氫鍵強(qiáng)度相關(guān)，對(duì)多糖的糖鏈構(gòu)象起主要作用[30]，MSHP中阿拉伯糖的含量較USHP和UMSHP多，故MSHP可形成氫鍵的帶電基團(tuán)多，多糖支鏈的靈活性較差，因此其表面結(jié)構(gòu)致密。原子力顯微鏡觀察結(jié)果與掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果吻合，因此推測超聲-微波協(xié)同作用使多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要方式是通過影響氫鍵之間的作用強(qiáng)度[25]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波、微波以及超聲-微波協(xié)同提取USHP、MSHP和UMSHP 3 種多糖，研究結(jié)果表明超聲-微波協(xié)同技術(shù)可提高大豆種皮多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù);因?yàn)? 種多糖均為β-D型甘露吡喃糖，說明超聲-微波協(xié)同技術(shù)未對(duì)多糖的糖環(huán)類型產(chǎn)生影響，但可使多糖支鏈的位置及數(shù)量發(fā)生變化;由USHP、MSHP和UMSHP的微觀構(gòu)像推測超聲-微波協(xié)同作用使多糖分子間排列方式和分子內(nèi)氫鍵作用強(qiáng)度發(fā)生變化，進(jìn)而對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生影響，其中MSHP結(jié)構(gòu)致密、穩(wěn)定性好，可能具有良好的乳化性;此外，超聲-微波協(xié)同作用可促進(jìn)大豆種皮多糖分子聚集及抑制糖醛酸中羧基的氧原子與糖鏈中氫原子結(jié)合形成的氫鍵。因此，推測超聲-微波協(xié)同技術(shù)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)影響的主要方式是影響多糖內(nèi)部氫鍵強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)可推廣大豆種皮多糖在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，并為超聲-微波協(xié)同技術(shù)在提取大分子物質(zhì)方面提供一定的理論依據(jù)。在后續(xù)研究中，可通過糖譜、核磁共振等指標(biāo)進(jìn)一步分析超聲-微波協(xié)同技術(shù)對(duì)大豆種皮多糖分子結(jié)構(gòu)的影響。