張松賀，周甜甜，劉遠(yuǎn)思

(河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098)

水體污染造成的水生植物消退、藻類(lèi)暴發(fā)以及生物多樣性降低等問(wèn)題已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[1-3]。水生植物作為初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性具有決定性的影響[4-5]。水生植物可以直接從水體吸收溶解態(tài)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)光合作用釋放氧氣，為水生動(dòng)物提供食物、棲息和產(chǎn)卵場(chǎng)所，在改善水質(zhì)、抑制沉積物再懸浮方面起著重要作用[6-8]。因而，恢復(fù)水生植物對(duì)修復(fù)水生態(tài)系統(tǒng)和防治水體富營(yíng)養(yǎng)化具有重要的意義。

浮葉植物和沉水植物的葉片通常漂浮或浸沒(méi)在水面，可以為細(xì)菌、藻類(lèi)和其他微生物提供附著空間，形成微生物群落[9]。水生植物與生物膜之間存在復(fù)雜的相互作用：一方面水生植物可以為附生微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微生態(tài)位[10]；另一方面水生植物分泌化感物質(zhì)，導(dǎo)致附生細(xì)菌群落的多樣性和宿主專(zhuān)一性[11]。葉片附著生物膜在水體污染物的分解、轉(zhuǎn)化和吸收方面起著重要作用的同時(shí)，還為水生植物提供光合作用所必需的二氧化碳，降低植物葉片受到的輻射[12]。然而，對(duì)植物表面附著微生物的結(jié)構(gòu)的研究尚不深入。

本研究以自然河流中4種水生植物(典型沉水植物金魚(yú)藻、伊樂(lè)藻和典型浮葉植物萍蓬草、菱角)表面的附著微生物為研究對(duì)象，利用熒光顯微鏡和電子顯微鏡觀(guān)測(cè)水生植物表面附著微生物的分布特征，并對(duì)藻類(lèi)組成進(jìn)行分析；利用高通量測(cè)序技術(shù)，比較分析4種水生植物表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異性，以期為河流水生態(tài)修復(fù)工程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

水樣(取自水面下50 cm處)和植物樣品于2015年7月采集于江蘇省宿遷市沭陽(yáng)縣新開(kāi)河(圖1)。新開(kāi)河地處農(nóng)村，周邊以農(nóng)田為主，無(wú)生活污水排入。植物樣品采集了沉水植物(金魚(yú)藻和伊樂(lè)藻)水面下10～20 cm處的新鮮葉片和浮葉植物(萍蓬草和菱角)新長(zhǎng)出的葉片和水面下20～30 cm處的須根。每種植物至少取自3個(gè)樣品點(diǎn)，同一種植物樣品點(diǎn)間隔不少于150 m。

圖1 新開(kāi)河采樣點(diǎn)位置

1.2 樣品測(cè)定

1.2.1水質(zhì)測(cè)定

TN質(zhì)量濃度采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定，TP質(zhì)量濃度采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定。河流的TN質(zhì)量濃度為(3.07±0.01) mg/L,TP質(zhì)量濃度為(0.11±0.04) mg/L，總體來(lái)講水質(zhì)較好。收集的樣品在4 ℃下冷藏，6 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存和處理。

1.2.2植物表面微生物數(shù)和附著藻類(lèi)密度的測(cè)定

采集植物葉片3～5片放入裝有10 mL磷酸緩沖液(pH值7.2)的離心管中，在225 r/min的速度下震蕩10 min，然后在50 W的功率超聲下清洗 1 min，將附著微生物從葉片上分離。為測(cè)定微生物濃度，選取100 μL不同稀釋梯度的混勻洗脫液，并加入700 μL濃度為10 μg/mL的DAPI工作液，避光染色30 min，過(guò)濾至0.22 μm的黑色背景whatman濾膜上,將濾膜制片在熒光顯微鏡下觀(guān)察、拍照后計(jì)數(shù)[13]。將洗脫完微生物的葉片取出，鋪平放置在鋪有保鮮膜的玻璃板上，在光下以直尺為對(duì)照進(jìn)行拍照，計(jì)算其表面積，后放入65 ℃烘箱內(nèi)至恒重，記下干質(zhì)重。

取出適量洗脫液，并加入適量的魯戈試劑固定。膠頭滴管滴2～3滴稀釋后的樣品于浮游生物計(jì)數(shù)框中央，蓋上蓋玻片，小心擦去蓋玻片周?chē)嘤嘁后w，放在顯微鏡下用40倍物鏡觀(guān)察。

1.2.3掃描電鏡分析

將切取后的樣品依次用30%、50%、70%、80%、90%的酒精脫水各15 min，再用100%的酒精脫水兩次，每次15 min，在冷凍干燥儀中干燥12 h后備用。處理后的樣品經(jīng)粘樣、噴金后使用日立S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀(guān)察[9]。

1.2.4附著生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定

洗脫的生物膜的主要來(lái)自金魚(yú)藻、伊樂(lè)藻、萍蓬根、萍蓬葉、菱角根、菱角葉，將洗脫的生物膜分裝、存放于2 mL離心管中冷凍保存(-80 ℃)。生物膜樣品DNA提取按照DNA提取試劑盒(MoBio Laboratories, USA)說(shuō)明進(jìn)行，每組樣品3個(gè)平行樣。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性和純度，同時(shí)利用NanoDrop One檢測(cè)DNA的濃度和純度。隨后對(duì)細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物為342F(5′-CTACGGGGGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACCGGGGTATCT-3′)。PCR反應(yīng)和高通量測(cè)序在上海美吉公司進(jìn)行，使用Roche 454 GS FLX+ Titanium測(cè)序平臺(tái)(Roche 454 Life Sciences, Branford, CT, U.S.)測(cè)序。利用QIIME(version 1.17)對(duì)原始序列進(jìn)行處理，得到高質(zhì)量序列。使用Usearch(vsesion 7.1)按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。最后采用RDP Classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類(lèi)水平——域、界、門(mén)、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的處理及作圖使用Origin 8.0。利用PAST生態(tài)學(xué)分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析,利用Heml軟件繪制熱圖(heatmap)，運(yùn)用“circlize”包通過(guò)RStudio軟件繪制弦圖。網(wǎng)絡(luò)圖(network)利用“psych”包基于Spearman相關(guān)系數(shù)在RStudio軟件上分析后，運(yùn)用Gephi進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水生植物葉片和根表面附著微生物密度

如表1所示，在同一水域中，金魚(yú)藻的單位質(zhì)量附著微生物密度最大，其次為萍蓬草根、萍蓬草葉、伊樂(lè)藻、菱角根和菱角葉。金魚(yú)藻單位葉面積附著微生物密度最大，其次為菱角、萍蓬草和伊樂(lè)藻。

表1 植物表面單位質(zhì)量和單位葉面積附著微生物密度

2.2 水生植物葉片附著生物膜結(jié)構(gòu)特征

圖2為金魚(yú)藻、伊樂(lè)藻、萍蓬草和菱角葉片表面的掃描電鏡照片。金魚(yú)藻葉片表面顆粒物較少，生物膜結(jié)構(gòu)不明顯，存在少量藻類(lèi)、桿菌和球菌；伊樂(lè)藻葉片表面顆粒物較多，生物膜結(jié)構(gòu)明顯，存在大量藻類(lèi)，未觀(guān)察到菌落；萍蓬草葉片表面顆粒物很多，生物膜結(jié)構(gòu)不明顯，只觀(guān)察到零散的幾個(gè)硅藻和桿菌；菱角葉片表面顆粒物較多，生物膜結(jié)構(gòu)明顯，觀(guān)察到大量藻類(lèi)和桿菌。

(a) 金魚(yú)藻

(b) 伊樂(lè)藻

(c) 萍蓬草

(d) 菱角

2.3 水體中浮游藻類(lèi)和水生植物葉片表面附著藻類(lèi)密度及組成

表2為水生植物表面的附著藻類(lèi)密度。在相同水域條件下，植物葉片單位質(zhì)量附著藻類(lèi)密度從大到小順序?yàn)椋阂翗?lè)藻，金魚(yú)藻，萍蓬草，菱角。植物葉片單位面積附著藻類(lèi)密度從大到小順序?yàn)椋航痿~(yú)藻，伊樂(lè)藻，菱角，萍蓬草。

表2 植物單位質(zhì)量和單位葉面積附著藻類(lèi)密度

從新開(kāi)河水體及水生植物葉片表面上共檢測(cè)出綠藻門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、硅藻門(mén)、黃藻門(mén)、隱藻門(mén)和裸藻門(mén)共6個(gè)門(mén)以及42個(gè)屬。不同植物類(lèi)型表面的藻類(lèi)有一定的差異，金魚(yú)藻和萍蓬草的優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)為硅藻門(mén)，其次為綠藻門(mén)和藍(lán)藻門(mén)；伊樂(lè)藻和菱角的優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)為綠藻門(mén)、硅藻門(mén)和藍(lán)藻門(mén)；新開(kāi)河水體里浮游藻類(lèi)的優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)依次為綠藻門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、硅藻門(mén)和裸藻門(mén)(圖3(a))。

(a) 門(mén)水平

(b) 屬水平

金魚(yú)藻、伊樂(lè)藻、萍蓬草和菱角葉片表面分別檢測(cè)出24、20、15和15種藻屬，而新開(kāi)河水體內(nèi)有19種藻屬，其中，10個(gè)藻屬均存在于4種水生植物葉片上，5個(gè)藻屬在新開(kāi)河水體和4種水生植物葉片上均有檢出。豐度最高的5個(gè)藻屬依次為：小球藻、微囊藻、卵形藻、雙菱藻和色球藻，其中小球藻和微囊藻在新開(kāi)河水體和4種水生植物葉片上的比例均較高，尤其是在水體里，卵形藻在萍蓬草上的比例遠(yuǎn)高于其他樣品，而雙菱藻在萍蓬草上的比例遠(yuǎn)低于其他樣品，色球藻只存在于水樣中(圖3(b))。

2.4 水生植物表面附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能

根據(jù)高通量數(shù)據(jù)結(jié)果的注釋?zhuān)瑢?duì)多樣性指數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果如表3所示。由Ace指數(shù)和Chao指數(shù)可知，金魚(yú)藻、萍蓬草根和菱角根附著生物膜群落豐度較高。由Shannon指數(shù)可知，萍蓬草根、伊樂(lè)藻和菱角根附著生物膜群落多樣性較高。根據(jù)OTU水平上的聚類(lèi)分析圖(圖4(a))，可知浮葉植物萍蓬草和菱角的根和葉表面附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

表3 水生植物樣品細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)和多樣性指數(shù)

6種表面生物膜樣品中共檢測(cè)出36個(gè)細(xì)菌門(mén)，包含有13個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)(至少1個(gè)樣品中的豐度大于1%)。金魚(yú)藻、伊樂(lè)藻、萍蓬草和菱角的根葉表面生物膜中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)類(lèi)依次為變形菌門(mén)(Proteobacteria，22.66%～48.37%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，0.97%～41.54%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi，18.51%～36.93%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，2.04%～11.86%)、酸桿菌門(mén)(Actinobacteria，3.11%～11.57%)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia，2.92%～10.69%)。變形菌門(mén)在各個(gè)樣品中相對(duì)豐度均較高，尤其在菱角葉片上；厚壁菌門(mén)在萍蓬草葉片和金魚(yú)藻上明顯高于伊樂(lè)藻、萍蓬草根、菱角葉片和根部，且在萍蓬草葉片上最高；擬桿菌門(mén)在金魚(yú)藻表面最高；綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)在菱角根和萍蓬草根表面較高(圖4(b))。在屬水平上，6個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)682個(gè)細(xì)菌屬，其中46個(gè)屬的相對(duì)豐度在至少一個(gè)樣品中大于1%，優(yōu)勢(shì)屬為微桿菌屬(Exiguobacterium)、Caldilineaceae_uncultured、Acidaminobacter屬、Enterobacteriaceae_unclassified、庫(kù)特氏菌屬(Kurthia)、Acidaminococcaceae_uncultured和Subgroup_6_norank。

(a) OTU水平聚類(lèi)

(b) 門(mén)水平弦圖

基于46個(gè)屬進(jìn)行共現(xiàn)性分析，結(jié)果如圖5所示。至少1個(gè)樣品中相對(duì)豐度大于1%，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)屬，每條邊代表所連的屬間的相關(guān)性，去除小于3個(gè)屬的組，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)。圖5有42個(gè)節(jié)點(diǎn)和102條邊，42個(gè)屬之間呈顯著性相關(guān)(Spearman’s |r|>0.6,p<0.05)，平均度為4.857，平均聚類(lèi)系數(shù)為0.559。在42個(gè)節(jié)點(diǎn)中，有29個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬隸屬于變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和疣微菌門(mén)。在102條邊中，其中有68條邊連接的屬呈正相關(guān)，34條邊連接的屬呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

沉水植物和浮葉植物及其根系上面都有大量的藻類(lèi)和細(xì)菌等微生物附著，沉水植物附生藻類(lèi)的密度顯著高于浮葉植物[14]，這些和植物葉片的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，如金魚(yú)藻的葉片為針狀，而伊樂(lè)藻的葉片較小，比浮葉植物的比表面積大，能為附著微生物提供更大的固著面積[15]。浮葉植物的附著微生物主要分布在葉片下方，使得藻類(lèi)獲取陽(yáng)光的效率降低，進(jìn)而影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)[14]。水體內(nèi)藻類(lèi)與不同植物表面附著藻類(lèi)的群落結(jié)構(gòu)間存在著一定的差異(圖3)。這些差異，一方面可能與宿主植物的結(jié)構(gòu)和化感作用有關(guān)[16]；另一方面，與浮游藻類(lèi)相比，附著在沉水植物表面的藻類(lèi)從水中和植物組織中獲取營(yíng)養(yǎng)方面具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

圖5 細(xì)菌主要屬之間相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

浮葉植物菱角和萍蓬草根單位質(zhì)量總菌數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均大于葉，浮葉植物的根表面細(xì)菌群落豐富度和多樣性較高。其主要原因一方面是菱角和萍蓬草葉片下表面存在大量的微生物，而葉片上表面由于暴露在空氣中會(huì)受到紫外線(xiàn)和水分減少的影響導(dǎo)致微生物較少[17]；另一方面是由于它們的根貼近沉積物，附著在根上的微生物棲息于特定的生態(tài)位，這些生態(tài)位的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源和環(huán)境參數(shù)可能受到植物根、地表水、沉積物成分甚至水生動(dòng)物的影響。因此，水生植物根上附著微生物豐富度和多樣性通常高于葉表面。

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，4種水生植物根和葉表面附著細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)依次為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)。不同水生植物和同種植物不同器官上附著細(xì)菌群落組成均不同，如伊樂(lè)藻、菱角葉片、菱角根和萍蓬草根上的優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)，而金魚(yú)藻和萍蓬草葉片上的優(yōu)勢(shì)門(mén)為厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)。這些結(jié)果表明不同植物載體乃至組織器官上附著的微生物群落具有一定的差異性，這與洪澤湖內(nèi)沉水和浮葉植物附著生物膜的結(jié)果相似[14]。已有研究表明，植物化感作用和分泌出的多酚類(lèi)等物質(zhì)可能是造成植物附生微生物量和微生物組成差異的主要因素之一[14]。細(xì)菌群落組成的差異性也可能與空間分布有關(guān)，萍蓬草和菱角的葉漂浮在水面上，而金魚(yú)藻和伊樂(lè)藻的整個(gè)植株浸在水中。水生植物空間分布不同，進(jìn)而生長(zhǎng)環(huán)境也不同，水流、光照條件和營(yíng)養(yǎng)濃度等方面也不同，從而導(dǎo)致細(xì)菌群落的差異性。植物表面微生物在水生態(tài)系統(tǒng)中能量轉(zhuǎn)換和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等方面起著關(guān)鍵作用，水生態(tài)系統(tǒng)中水生植物的修復(fù)可以增加微生物的多樣性和數(shù)量，增加生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

變形菌門(mén)內(nèi)大多數(shù)都是兼性或?qū)Ｐ詤捬醯漠愷B(yǎng)細(xì)菌，對(duì)有機(jī)物和氮的去除有重要作用[18]。根據(jù)圖4，組一和組二內(nèi)的屬間主要呈正相關(guān)關(guān)系，其中，組一內(nèi)的屬主要來(lái)自芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱，主要分布在伊樂(lè)藻和菱角葉片表面，γ-變形菌和β-變形菌是污水處理系統(tǒng)中參與有機(jī)質(zhì)降解的主要細(xì)菌[19-20]，具有降解復(fù)雜有機(jī)大分子的能力。而組二中的屬主要來(lái)自α-變形菌綱，Rhodobacter、Rhizobium、Rhodobacteraceae_unclassified、Hyphomicrobium和MNG7_norank屬間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，主要分布在浮葉植物葉片上。Rhodobacter、Rhizobium、Rhodobacteraceae_unclassified和Hyphomicrobium均是好氧反硝化菌，能在好氧條件下進(jìn)行反硝化。生絲微菌屬可以在處理成熟堆填區(qū)滲濾污水方面發(fā)揮重要作用，芽孢桿菌屬能吸收利用多種有機(jī)碳源，假單胞菌屬可以降解碳?xì)浠衔?。然而，?變形菌綱內(nèi)的Aeromonas與組二內(nèi)的Hyphomicrobium、Rhodobacter和MNG7_norank呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(主要分布在浮葉植物葉片上)，而Aeromonas也可與厚壁菌門(mén)內(nèi)的Acidaminobacter和擬桿菌門(mén)內(nèi)的Paludibacter、vadinBC27_wastewater-sludge_group呈正相關(guān)關(guān)系(主要分布在金魚(yú)藻上)。有研究顯示Acidaminobacter、Aeromonas和Paludibacter為嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧菌[21]。金魚(yú)藻葉片能夠吸附大量懸浮顆粒物，可能為這些厭氧或兼性厭氧菌提供了低氧或無(wú)氧環(huán)境。

組三內(nèi)的屬來(lái)自10個(gè)門(mén)，主要來(lái)自疣微菌門(mén)和綠彎菌門(mén)。其中變形菌門(mén)的屬Comamonadaceae_unclassified與酸桿菌門(mén)內(nèi)的Subgroup_4_norank、擬桿菌門(mén)的Saprospiraceae_uncultured、綠彎菌門(mén)內(nèi)的Chloroflexi_uncultured、Armatimonas屬和疣微菌門(mén)內(nèi)的Verrucomicrobiaceae_unclassified和OPB35_soil_group_norank屬呈顯著正相關(guān)關(guān)系，主要分布在萍蓬草和菱角的根部；而Kurthia和Peptostreptococcaceae_incertae_sedis(厚壁菌門(mén)，主要分布在萍蓬草葉表面)均與OPB35_soil_group_norank、Candidate_division_WS3_norank、Candidate_division_BRC1_norank和Sphingomonadales_unclassified呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。綠彎菌門(mén)是光合自養(yǎng)菌，兼性厭氧，可降解難降解的有機(jī)碳。綠彎菌門(mén)可能附著在萍蓬草和菱角靠近沉積物的低氧環(huán)境中。有研究表明酸桿菌門(mén)在根際土壤中含量豐富，具有較高的代謝活性，而疣微菌門(mén)普遍存在于土壤中[22]。擬桿菌和厚壁菌對(duì)有機(jī)物的降解起到非常重要的作用。綜上所述，呈正相關(guān)關(guān)系的屬以相對(duì)較高的豐度出現(xiàn)在同一載體上，而呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的屬則出現(xiàn)在不同載體上，即不同種類(lèi)或同種植物不同部位地附著于生物膜內(nèi)。這些菌的生態(tài)功能需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

a. 新開(kāi)河4種水生植物中，沉水植物金魚(yú)藻和浮葉植物萍蓬草、菱角的根表面微生物群落豐度較高；萍蓬草根、伊樂(lè)藻和菱角根表面附著群落多樣性較高；金魚(yú)藻單位質(zhì)量和單位面積表面附著總菌數(shù)最高，金魚(yú)藻和伊樂(lè)藻單位質(zhì)量和單位面積附著藻類(lèi)密度最高。

b. 4種水生植物附生藻類(lèi)優(yōu)勢(shì)門(mén)相同，而附生藻類(lèi)組成與周?chē)w的藻類(lèi)組成不同。

c. 不同水生植物表面附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均不相同，附生細(xì)菌群落具有多樣性和宿主專(zhuān)一性。萍蓬草和菱角的根表面細(xì)菌群落組成相似性較高，而與4種水生植物葉片表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。