謝玉霞，姜海兵，楊潔，劉文寧，梁鋮，張靜

冠心病屬于缺血性心臟病，是指冠狀動脈粥樣硬化致使管腔狹窄或閉塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病。有研究表明，年齡、吸煙、血壓、血脂有關(guān)成分、代謝相關(guān)因子、炎性因子、基因多態(tài)性、心理因素等與冠心病發(fā)生密切相關(guān)，其中血脂異常是誘發(fā)冠心病的一個重要因素［1］。目前，臨床針對冠心病除采用擴(kuò)張血管藥物對癥治療外，還需給予控制心率、血脂、血糖等病因治療。據(jù)《全球疾病負(fù)擔(dān)研究》報道，冠心病是全球人類死亡的首要原因［2］。近年臨床研究表明，多數(shù)冠心病患者伴嚴(yán)重高血脂及血管內(nèi)皮損傷，因此調(diào)節(jié)血脂、減輕血管內(nèi)皮損傷至關(guān)重要［3-4］。線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑是一種可延緩冠心病病情發(fā)展的有效藥物，其對心肌缺血及再灌注損傷具有有效的保護(hù)作用［5］。二氮嗪是一種典型的線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑，常用于冠心病的臨床治療［6-7］，但其對血脂和血管內(nèi)皮損傷影響及作用機(jī)制的報道相對較少。本研究旨在探討線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠血脂代謝和血管內(nèi)皮損傷的影響及機(jī)制，以為臨床研究提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2018年8月—2019年2月，選取6周齡健康清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，平均體質(zhì)量（180±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號：SYXK（x-2019-00002）。50只大鼠均在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，室溫20～23 ℃，人工光照，陰暗各12 h，自由飲食。

1.2 主要藥物、儀器 二氮嗪（上海博頓生物化工有限公司生產(chǎn)）、垂體后葉素（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）、成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF-2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、β-actin抗體、山羊抗鼠二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；HITACH17080全自動生化分析儀（上海曼普生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將50只6周齡大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。除對照組外，其他組大鼠均喂養(yǎng)高脂飼料（包含膽固醇1.0%，蛋黃粉5.0%，豬油10.0%，膽酸鈉0.5%，基礎(chǔ)飼料83.5%）6周，而后腹腔注射垂體后葉素6 U/kg，1次/d，持續(xù)3 d，進(jìn)行造模。造模結(jié)束后，低、中、高劑量組大鼠分別按照二氮嗪3、5、7 mg/kg進(jìn)行灌胃治療，1次/d，而對照組、模型組大鼠給予相同體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d；5組大鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.4 標(biāo)本采集 治療后處死所有大鼠并采集其頸總動脈標(biāo)本，以4%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蠟包埋標(biāo)本后連續(xù)切片，按照以下步驟進(jìn)行HE染色：將石蠟切片置入烘箱（溫度60 ℃）烤1～2 h→石蠟切片常規(guī)予以二甲苯，乙醇溶液脫蠟至水→蘇木精染10 min→流水沖洗，去余色→0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘→流水沖洗，切片變藍(lán)約15 min→95%乙醇溶液沖洗30 s→酒精性伊紅染30 s→Ⅰ 95%乙醇溶液沖洗30 s→Ⅱ 95%乙醇溶液沖洗30 s→Ⅰ 100%乙醇溶液沖洗30 s→Ⅱ100%乙醇溶液沖洗30 s→石碳酸二甲苯?jīng)_洗30 s→Ⅰ二甲苯浸泡30 s→Ⅱ二甲苯浸泡30 s→中性樹膠封固，最后置于光鏡下觀察。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血脂指標(biāo) 分別于治療前后采集五組大鼠眼角靜脈叢血2 ml，室溫靜置4 h，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，利用全自動生化分析儀檢測血脂指標(biāo)，包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.5.2 羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶活性 治療后摘除五組大鼠眼球并取血5 ml 3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液800 μl，而后依次加入還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）100 μl、反應(yīng)緩沖液（包括0.2 mol/L KCl、0.16 mol/L K2HPO4、4 mmol/L EDTA和10 mmol/L 二硫蘇糖醇）100 μl，反應(yīng)總體積為1 ml，先進(jìn)行37 ℃預(yù)溫浴20 min，而后采用紫外分光光度法檢測OD340值，OD340值越高提示HMG-CoA還原酶活性越弱，反之活性越強(qiáng)。

1.5.3 頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量 治療后在無菌條件下取五組大鼠頸動脈組織，加入裂解液和蛋白酶抑制劑后于4 ℃勻漿后繼續(xù)裂解30 min，12 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），提取總蛋白；BCA蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對聚偏二氟乙烯（PVDF）凝膠電泳膜封閉2 h，而后以稀釋后的β-actin、FGF-2及VEGF一抗于4 ℃孵育過夜，洗膜后室溫孵育二抗1.5 h，洗膜后將PVDF膜浸入發(fā)光液，曝光并拍照，采用Western blotting法進(jìn)行檢測，并使用Image J軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠治療前血脂指標(biāo)比較 治療前五組大鼠TC、TG、LDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療前五組大鼠HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療前模型組及低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 五組大鼠治療前血脂指標(biāo)比較（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of blood lipid parameters in the five groups before treatment

表1 五組大鼠治療前血脂指標(biāo)比較（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of blood lipid parameters in the five groups before treatment

注：TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇；與對照組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) TC TG LDL-C HDL-C對照組 10 1.34±1.13 0.61±1.10 0.19±0.91 0.55±1.21模型組 10 2.10±1.19a0.84±1.18a0.59±1.16a0.60±0.97低劑量組 10 1.98±1.24a0.83±1.11a0.60±0.92a0.58±1.16中劑量組 10 2.08±0.88a0.79±1.13a0.61±0.94a0.49±1.15高劑量組 10 2.00±0.97a0.81±1.09a0.57±1.18a0.62±0.99 F值 75.113 31.040 62.453 1.772 P值 0.001 0.018 0.001 0.211

2.2 五組大鼠治療后血脂指標(biāo)比較 治療后五組大鼠TC、TG、LDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后五組大鼠HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后模型組及低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平高于對照組，低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平低于模型組，中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平低于低劑量組，高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平低于中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 五組大鼠治療后眼球血OD340值比較 治療后五組大鼠眼球血OD340值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后模型組大鼠OD340值低于對照組，中、高劑量組大鼠OD340值高于對照組，低、中、高劑量組大鼠OD340值高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.4 五組大鼠治療后頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量比較 治療后五組大鼠頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后模型組及低、中劑量組大鼠頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量高于對照組，低、中、高劑量組大鼠頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4、圖1）。

表2 五組大鼠治療后血脂指標(biāo)比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups after treatment

表2 五組大鼠治療后血脂指標(biāo)比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups after treatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) TC TG LDL-C HDL-C對照組 10 1.41±1.08 0.70±1.13 0.17±1.01 0.54±2.18模型組 10 4.50±2.11a 3.93±1.16a 2.68±0.93a0.58±1.81低劑量組 10 3.60±0.81ab 2.98±0.63ab 1.56±1.07ab0.56±1.69中劑量組 10 2.50±1.12abc2.01±1.15abc0.89±1.10abc0.47±1.72高劑量組 10 1.90±1.04abcd1.46±0.81abcd0.46±1.08abcd0.63±2.08 F值 20.190 71.353 375.844 2.390 P值 0.034 0.011 0.001 0.120

表3 五組大鼠治療后眼球血OD340值比較（±s，mmol/L）Table 3 Comparison of eyeball blood OD340 in the five groups after treatment

表3 五組大鼠治療后眼球血OD340值比較（±s，mmol/L）Table 3 Comparison of eyeball blood OD340 in the five groups after treatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) O D 340值對照組 1 0 0.4 5±4.3 2模型組 1 0 0.2 4±3.6 7 a低劑量組 1 0 0.4 2±4.1 1 b中劑量組 1 0 0.6 3±4.8 7 ab高劑量組 1 0 0.7 0±3.9 8 ab F值 2 9.0 2 6 P值 0.0 1 1

表4 五組大鼠治療后頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量比較（± s，%）Table 4 Comparison of relative expression quantity of FGF-2 and VEGF of carotid vascular endothelial cells in the five groups after treatment

表4 五組大鼠治療后頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF相對表達(dá)量比較（± s，%）Table 4 Comparison of relative expression quantity of FGF-2 and VEGF of carotid vascular endothelial cells in the five groups after treatment

注：FGF-2=成纖維細(xì)胞生長因子2，VEGF=血管內(nèi)皮生長因子；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) FGF-2 VEGF對照組 10 20.63±2.12 24.57±1.13模型組 10 106.95±3.23a 100.66±2.97a低劑量組 10 68.80±2.76ab 74.93±1.68ab中劑量組 10 56.77±2.97ab 63.74±1.03ab高劑量組 10 25.56±2.46b 30.65±2.37b F值 570.478 1103.593 P值 0.024 0.011

3 討論

圖1 五組大鼠Western blotting檢測結(jié)果Figure 1 Western blotting detection results in the five groups

冠心病是指冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致管腔狹窄或閉塞，進(jìn)而出現(xiàn)心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病。研究表明，血脂異常是誘發(fā)心血管事件的危險因素，血脂指標(biāo)長期升高會破壞動脈完整性，導(dǎo)致血管破損，若血小板及血脂長期聚集于破損處或發(fā)生鈣化，則會導(dǎo)致動脈管腔狹窄甚至閉塞，進(jìn)而導(dǎo)致心臟病發(fā)生［8-9］。二氮嗪是一種線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑，現(xiàn)已廣泛用于冠心病的治療，但其對血脂和血管內(nèi)皮損傷影響的相關(guān)報道相對較少［10］。本研究通過構(gòu)建冠心病大鼠模型，探究線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠血脂代謝及血管內(nèi)皮損傷的影響及機(jī)制。

高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥與冠心病存在一定關(guān)聯(lián)［11］。高甘油三酯血癥是冠心病的獨(dú)立危險因素，LDL-C、TG、TC水平異常升高可誘發(fā)心血管斑塊形成，長期積累加之肢體活動等可進(jìn)一步導(dǎo)致斑塊破裂，繼而發(fā)生嚴(yán)重的心血管事件［12］。HMG-CoA還原酶是人體生物合成血脂過程中的限速酶，可催化底物HMG-CoA生成甲羥戊酸，是體內(nèi)合成膽固醇的限速步驟，因此HMG-CoA還原酶活性與血脂水平密切相關(guān)，也是調(diào)節(jié)血脂藥物的重要作用靶點(diǎn)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，治療前模型組和低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平高于對照組，提示冠心病大鼠造模成功。治療后模型組與低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均高于對照組，低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于模型組，中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于低劑量組，高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于中劑量組，但五組大鼠HDL-C水平間無差異，可見二氮嗪可明顯降低冠心病大鼠LDL-C、TG、TC水平，但不明顯改變HDL-C水平。另外，治療后模型組大鼠OD340值低于對照組，中、高劑量組大鼠OD340值高于對照組，低、中、高劑量組大鼠OD340值高于模型組，表明該藥物可通過抑制HMGCoA還原酶活性達(dá)到降血脂的作用。

在血管形成過程中，有諸多血管生長因子如FGF-2、VEGF參與調(diào)節(jié)。FGF-2可刺激蛋白酶原活化因子與內(nèi)皮細(xì)胞分泌蛋白酶，導(dǎo)致血管基底膜降解，使細(xì)胞侵入周圍基質(zhì)，從而形成新的、具有空腔的血管。VEGF能夠特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及增殖，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管通透性，使血管內(nèi)成分滲漏，但FGF-2、VEGF過表達(dá)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮破損［15-16］。本研究結(jié)果顯示，治療后低、中、高劑量組大鼠FGF-2、VEGF相對表達(dá)量低于模型組，表明二氮嗪能夠明顯降低冠心病大鼠FGF-2和VEGF表達(dá)量，提示可通過下調(diào)FGF-2和VEGF表達(dá)量達(dá)到減輕血管內(nèi)皮損傷的目的。

綜上所述，線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑可通過抑制HMG-CoA還原酶活性而改善冠心病大鼠血脂代謝，并可通過下調(diào)頸動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF-2及VEGF的表達(dá)量而減輕血管內(nèi)皮損傷，但本研究并未對FGF-2及VEGF相關(guān)信號通路中其他蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，因此線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠的血脂及血管保護(hù)作用具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

作者貢獻(xiàn)：謝玉霞、姜海兵、楊潔進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；謝玉霞、楊潔、劉文寧、梁鋮進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；謝玉霞、梁鋮、張靜進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；楊潔、劉文寧、張靜進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；謝玉霞撰寫論文，進(jìn)行論文的修訂；謝玉霞、姜海兵負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；姜海兵對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。