姜 姍，李 霞，李狀狀，楊艷津，王 鈺，朱元辰，秦艷杰

( 大連海洋大學(xué)，遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)是現(xiàn)代毒理學(xué)效應(yīng)評(píng)估的主要手段，可以有效地評(píng)估重金屬暴露對(duì)生物體的毒性效應(yīng)和對(duì)生態(tài)環(huán)境的健康風(fēng)險(xiǎn)。理想的生物標(biāo)志物要求能夠敏感有效地反映出生物體發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷之前的生物學(xué)指標(biāo)變化，并能準(zhǔn)確評(píng)估生物體所處的污染狀態(tài)及其潛在危害，為嚴(yán)重毒性效應(yīng)的出現(xiàn)提供早期警報(bào)[1]。體外培養(yǎng)的魚類細(xì)胞可以直接和污染物接觸，具有靈敏度高、均一性好、觀察方便等特點(diǎn)，是毒理學(xué)研究中理想的生物標(biāo)志物。早在1968年研究者首次利用體外培養(yǎng)的魚類肌肉細(xì)胞系檢測(cè)環(huán)境中鋅的毒性作用，得出細(xì)胞存活率與鋅離子濃度之間呈正相關(guān)的毒性效應(yīng)[2]。之后的系列毒性效應(yīng)研究結(jié)果表明，重金屬因種類、狀態(tài)、細(xì)胞系類別和代數(shù)不同，其毒性效應(yīng)差別明顯[3-7]，鋅和銅兩種重金屬對(duì)大多數(shù)細(xì)胞系表現(xiàn)為中度毒性，但毒性效應(yīng)并沒有一定的規(guī)律性。

生物體內(nèi)DNA、RNA等遺傳物質(zhì)受內(nèi)外因素影響會(huì)發(fā)生斷裂、缺失等損傷，從而引起系列的遺傳損傷。遺傳損傷常用的檢測(cè)方法包括DNA電泳、彗星試驗(yàn)、微核等。研究發(fā)現(xiàn)，草魚(Ctenopharyngodonidellus) ZC7901細(xì)胞[8]，野生細(xì)鱗(Theraponjarbua)鰭細(xì)胞系(JF細(xì)胞)，羅非魚(Oreochromis)卵巢細(xì)胞系(TO-2細(xì)胞)[9]，烏鱧(Channaargus)肝細(xì)胞[10]，金頭鯛(Sparusaurata)SAF-1細(xì)胞系[11]，泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)DIMF、TRMF細(xì)胞系[12-13]等在不同重金屬誘導(dǎo)下均出現(xiàn)不同程度的DNA特異降解、斷裂和損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞損傷程度和凋亡比例與重金屬種類、重金屬濃度及細(xì)胞種類有關(guān)。金屬硫蛋白是細(xì)胞內(nèi)與重金屬結(jié)合相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)，其生理功能主要包括調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)金屬離子含量、抗氧化作用、參與細(xì)胞調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等。另外，由于金屬硫蛋白能夠響應(yīng)重金屬脅迫，并在一定范圍內(nèi)反映重金屬污染及其毒性效應(yīng)的程度，早在20世紀(jì)70年代就有學(xué)者指出，水生動(dòng)物金屬硫蛋白可以作為指示水環(huán)境重金屬污染物毒性效應(yīng)早期預(yù)警的重要生物標(biāo)志物，用以評(píng)價(jià)重金屬污染物的毒性，指示重金屬對(duì)生物體和環(huán)境的污染程度[14]。

筆者以實(shí)驗(yàn)室此前建立的泥鰍鰭細(xì)胞系為試驗(yàn)材料，探究硫酸銅和氯化鋅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系的遺傳學(xué)損傷及金屬硫蛋白基因表達(dá)的影響，旨在探究必需重金屬對(duì)泥鰍細(xì)胞的遺傳毒性，為研究重金屬的生理學(xué)功能及重金屬環(huán)境監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用60～70代泥鰍鰭細(xì)胞系(DIMF)是大連海洋大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室于2012年建立的。細(xì)胞系培養(yǎng)采用含15%胎牛血清(FBS，Omega)的DME/F12培養(yǎng)基于25 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞系染毒處理

取處于對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的鰭細(xì)胞系，用0.25%的胰蛋白酶消化處理貼壁細(xì)胞成懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出細(xì)胞密度并調(diào)整到密度為2×105個(gè)/mL，每孔以200 μL的量接種到96孔板上，或者以5 mL的細(xì)胞量接種到25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2，25 ℃)中培養(yǎng)24 h后，棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，加入相同體積、添加濃度為0、200、400、800、1600 μmol/L氯化鋅的新細(xì)胞培養(yǎng)液；另一個(gè)試驗(yàn)添加濃度為0、100、200、400、800 μmol/L硫酸銅的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行組，然后放置于25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(彗星試驗(yàn))

單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行，并略有改動(dòng)。取預(yù)熱的磨砂載玻片浸入45 ℃、0.7%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖中，迅速加蓋玻片使膠鋪平，放置于4 ℃固化過夜，制成第一層膠。取下蓋玻片，將各濃度分別染毒的細(xì)胞處理成懸液，以1∶7的比例與37 ℃、0.8%瓊脂糖(0.08 g低熔點(diǎn)瓊脂糖溶于7 mL TAE緩沖液中)混合，取混合液100 μL加到第一層膠上，蓋上蓋玻片，4 ℃固化10 min。固化好的載玻片在冰冷的堿性裂解液中低溫避光裂解1 h。從裂解液中取出載玻片，用蒸餾水將其沖洗3次，然后放置于電泳液(0.186 g Na2EDTA和6 g NaOH溶于500 mL去離子水中，pH調(diào)整為13.0)中，低溫避光解旋30 min。設(shè)置電壓為25 V，電流為200 mA，調(diào)整電泳液液面使電流保持為200 mA，低溫避光電泳30 min。電泳結(jié)束后，取出載玻片，用蒸餾水清洗3次，保存于潮濕的片盒中，觀察時(shí)每片滴加25 μL 20 μg/L的溴化乙啶，蓋上蓋玻片即可進(jìn)行觀察。

在波長為460 nm時(shí)用200倍熒光顯微鏡觀察并拍照。用彗星分析軟件(CASP)處理分析彗星試驗(yàn)結(jié)果圖，每個(gè)濃度處理分析200個(gè)細(xì)胞，測(cè)量拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA比例、彗星尾距和Olive尾矩5項(xiàng)數(shù)據(jù)。

1.2.3 金屬硫蛋白表達(dá)量的測(cè)定

將不同濃度氯化鋅和硫酸銅染毒的細(xì)胞用胰蛋白酶處理成懸浮細(xì)胞，放置離心管中以4000 r/min離心3 min，用1 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸，按照總RNA提取試劑盒(TaKaRa)的方法提取細(xì)胞總RNA，并用水平電泳儀和核酸分析儀檢測(cè)RNA完整性、含量和純度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果將RNA質(zhì)量濃度調(diào)整為500 ng/μL。按照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以20 μL RNA反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以泥鰍β-Actin基因(AB200265)作為內(nèi)參基因，根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]設(shè)計(jì)金屬硫蛋白擴(kuò)增引物。按照全式金實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒步驟，以20 μL體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果以2-ΔΔCt法處理：

ΔΔCt=(樣品Ct-內(nèi)參Ct)-(對(duì)照Ct-內(nèi)參Ct)

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較分析采用SPSS 16.0軟件檢驗(yàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異顯著性，P<0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 硫酸銅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系DNA損傷的影響

顯微觀察和對(duì)應(yīng)的CASP彗星軟件處理結(jié)果見圖1。倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常未處理的細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解并電泳后，移動(dòng)距離較短，且細(xì)胞多以圓形存在，邊界較清晰(圖1a)；硫酸銅濃度為100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞也接近圓形，但邊緣有所擴(kuò)大且模糊不清(圖1b)；硫酸銅濃度為200 μmol/L細(xì)胞邊緣進(jìn)一步擴(kuò)大，且出現(xiàn)拖尾情況，尾部輪廓寬大呈放射狀(圖1c)；當(dāng)硫酸銅濃度為400、800 μmol/L時(shí)，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的拖尾情況，尾部范圍逐漸擴(kuò)大，且逐漸清晰拉長(圖1d～e)?？傮w來看，隨著硫酸銅濃度的升高，其彗星尾部范圍逐漸增大。軟件分析中各彗星圖片的數(shù)量指標(biāo)(表1)表明，當(dāng)硫酸銅濃度為100 μmol/L時(shí)，僅拖尾率與對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，其他4個(gè)指標(biāo)均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)硫酸銅濃度為200、400 μmol/L和800 μmol/L時(shí)，5個(gè)數(shù)量指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 硫酸銅處理后泥鰍鰭細(xì)胞系的彗星試驗(yàn)結(jié)果

表1 硫酸銅處理后泥鰍鰭細(xì)胞系的DNA損傷情況

注：同一列中，*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05),下同.

Note: * means significant different in the same column from the control group, et sequentia.

2.2 硫酸銅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系MT表達(dá)量的影響

泥鰍鰭細(xì)胞系經(jīng)不同濃度硫酸銅染毒處理24 h之后，細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量見圖2，泥鰍細(xì)胞金屬硫蛋白的表達(dá)量隨著硫酸銅濃度的增大均呈先穩(wěn)定后下降的趨勢(shì)，在硫酸銅濃度為100 μmol/L時(shí)，金屬硫蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)硫酸銅濃度為200、400、800 μmol/L時(shí)，金屬硫蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01)。

圖2 不同濃度硫酸銅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 氯化鋅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞DNA損傷的影響

顯微觀察和對(duì)應(yīng)的CASP彗星軟件處理結(jié)果見圖3。倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常未凋亡的細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解并電泳后，移動(dòng)距離較短，且細(xì)胞多以圓形存在(圖3a)；氯化鋅濃度為200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞也接近圓形，但邊緣有所擴(kuò)大且模糊不清(圖3b)；氯化鋅濃度為400、800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞邊緣進(jìn)一步擴(kuò)大，且出現(xiàn)拖尾情況，尾部輪廓寬大呈放射狀(圖3c～d)；氯化鋅濃度為1600 μmol/L時(shí)，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的拖尾情況，尾部清晰且拉長(圖3e)。綜合來看，可見隨著氯化鋅濃度的升高，彗星尾部從放射狀逐漸清晰并拉長。

軟件分析中各彗星圖片的數(shù)量指標(biāo)(表2)表明，當(dāng)氯化鋅濃度為200 μmol/L時(shí)，僅拖尾率與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，其他4個(gè)指標(biāo)均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)氯化鋅濃度為400、800、1600 μmol/L時(shí)，5個(gè)數(shù)量指標(biāo)均與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

圖3 氯化鋅處理后泥鰍鰭細(xì)胞系的彗星試驗(yàn)結(jié)果

表2 氯化鋅處理后泥鰍鰭細(xì)胞系的DNA損傷情況

2.4 氯化鋅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞系金屬硫蛋白表達(dá)量的影響

金屬硫蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的試驗(yàn)結(jié)果見圖4，氯化鋅濃度為200 μmol/L時(shí)，泥鰍鰭細(xì)胞中金屬硫蛋白mRNA的表達(dá)量即顯著高于對(duì)照組，在400 μmol/L氯化鋅處理時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大值，是對(duì)照組的1.23倍，此后細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白表達(dá)量急劇下降，在800、1600 μmol/L時(shí)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，且1600 μmol/L時(shí)泥鰍鰭細(xì)胞系金屬硫蛋白相對(duì)表達(dá)量接近于0。

3 討 論

3.1 重金屬引起泥鰍細(xì)胞DNA損傷的機(jī)理

重金屬能夠誘導(dǎo)魚類細(xì)胞系凋亡或壞死，均可以表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)DNA損傷[8,10]。本研究彗星試驗(yàn)的結(jié)果顯示，銅、鋅兩種重金屬會(huì)不同程度地引起泥鰍細(xì)胞的DNA損傷。與對(duì)照組相比，當(dāng)硫酸銅濃度為200 μmol/L，氯化鋅濃度為400 μmol/L時(shí)，拖尾率、細(xì)胞彗尾DNA比例、彗星尾長、慧尾DNA比例、尾距和Olive尾距5個(gè)指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組。且泥鰍細(xì)胞的DNA損傷程度與兩種重金屬濃度之間存在明顯的劑量依賴關(guān)系，這種現(xiàn)象與譚鳳霞等[17-19]的研究結(jié)果類似。分析認(rèn)為，銅和鋅均為生物體必需元素，參與多種酶催化的生化反應(yīng)，但超過機(jī)體內(nèi)必需濃度時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基，這些活性自由基攻擊DNA鏈?zhǔn)蛊浒l(fā)生斷裂，從而通過單細(xì)胞凝膠電泳可觀察到明顯的DNA損傷。

圖4 不同濃度氯化鋅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

3.2 銅和鋅對(duì)泥鰍細(xì)胞金屬硫蛋白的誘導(dǎo)作用

金屬硫蛋白可以對(duì)進(jìn)入生物有機(jī)體的重金屬進(jìn)行捕獲和儲(chǔ)存，進(jìn)而降低其對(duì)生物體細(xì)胞和組織的毒性作用[20]，因此在生物受到重金屬脅迫的研究中經(jīng)常被作為應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)。重金屬在魚體組織器官的積累的相關(guān)研究表明，鰭組織可能不是金屬硫蛋白表達(dá)的最主要部位[21-22]，因此，本試驗(yàn)對(duì)照組泥鰍鰭細(xì)胞系的金屬硫蛋白表達(dá)量很低，這與王磊[23]在活體泥鰍鰭組織中金屬硫蛋白表達(dá)量很低的報(bào)道相符。但是在重金屬刺激下，細(xì)胞金屬硫蛋白表達(dá)量會(huì)存在不同程度的誘導(dǎo)現(xiàn)象。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，硫酸銅處理后泥鰍細(xì)胞金屬硫蛋白表達(dá)量僅在低濃度時(shí)維持與對(duì)照組一致的水平，隨著硫酸銅濃度的升高金屬硫蛋白表達(dá)量顯著降低；而氯化鋅處理后，泥鰍鰭細(xì)胞金屬硫蛋白表達(dá)量顯著升高，超過一定濃度后顯著下降。說明一定范圍的氯化鋅脅迫后，泥鰍鰭細(xì)胞會(huì)通過金屬硫蛋白的表達(dá)水平維持或增加，對(duì)相應(yīng)重金屬進(jìn)行捕獲和解毒，從而避免了重金屬對(duì)細(xì)胞造成的DNA損傷、代謝紊亂、氧化損傷等。類似的解毒機(jī)制在Cheuk等[6,24]對(duì)斑馬魚尾鰭細(xì)胞系和肝細(xì)胞系中均有報(bào)道。超過一定濃度范圍的硫酸銅和氯化鋅處理，重金屬誘導(dǎo)表達(dá)的金屬硫蛋白無法繼續(xù)捕獲更多的重金屬，使得這些重金屬直接或間接地干擾DNA的遺傳控制和修復(fù)機(jī)制，同時(shí)也可能使機(jī)體產(chǎn)生過多的自由基而引起DNA堿基突變，這些DNA損傷的累積將最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

3.3 不同細(xì)胞對(duì)重金屬的敏感性差異

鋅參與DNA聚合酶、RNA聚合酶的合成，參與和維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，而濃度過高時(shí)影響這兩種聚合酶的活性，直接影響膜性結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)雙分子層生理穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。同時(shí)，高濃度的鋅還會(huì)影響鐵、銅、鈣等的吸收和代謝[25-26]。銅是真核生物代謝過程中重要的微量元素，是機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的重要組成，許多關(guān)鍵的酶均需要銅的參與和活化。體內(nèi)的銅主要依靠超氧化物歧化酶和金屬硫蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，過量的銅對(duì)細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)在能量代謝降低、氧化損傷及DNA損傷[27]?？梢?，兩種重金屬對(duì)生物體及細(xì)胞的毒性機(jī)理不同，細(xì)胞對(duì)兩種重金屬的耐受機(jī)理也勢(shì)必會(huì)存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，硫酸銅和氯化鋅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞的毒性效應(yīng)存在一定差異，泥鰍鰭細(xì)胞系對(duì)氯化鋅的耐受力更強(qiáng)，而對(duì)硫酸銅更加敏感。類似的，Park等[28]通過研究敲除金屬硫蛋白基因的小鼠發(fā)現(xiàn)，金屬硫蛋白對(duì)一些金屬解毒能力的順序?yàn)镃d>Zn>Cu>Ag；譚鳳霞等[7]研究了Zn2+、Cd2+、Cu2+和Cr6+4種重金屬對(duì)稀有鯽鰭細(xì)胞系的毒性作用，結(jié)果顯示，4種重金屬對(duì)稀有鯽鰭細(xì)胞的毒性效應(yīng)均隨傳代數(shù)的增大而呈下降的趨勢(shì)，且4種重金屬毒性大小為Cr+6>Cd2+>Cu2+>Zn2+；這些報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果相似。但Tan等[5]研究了4種重金屬對(duì)草魚鰭條細(xì)胞系(GCF)、草魚腎細(xì)胞系(CIK)、鯉魚(Cyprinuscarpio)上皮瘤細(xì)胞系(EPC)、斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)卵巢細(xì)胞系(CCO)，褐色大頭鲇(Ameiurusnebulosus)肌肉細(xì)胞系(BB)和黑頭呆魚(Pimephalespromelas)肌肉細(xì)胞系(FHM)6種魚類細(xì)胞系細(xì)胞毒性的作用，結(jié)果表明，6種細(xì)胞系對(duì)4種重金屬的敏感性大小為Cr>Cd>Zn>Cu。究其原因，可能是與動(dòng)物種類、細(xì)胞種類及不同重金屬形態(tài)(價(jià)態(tài)、不同陰離子根等)有關(guān)[29-30]。

4 結(jié) 論

綜合本研究中單細(xì)胞凝膠電泳及金屬硫蛋白的表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)銅對(duì)泥鰍鰭細(xì)胞的毒性效應(yīng)更大，而鋅可以通過誘導(dǎo)金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而短暫減緩對(duì)細(xì)胞的損傷。