費越越，南星羽，余 路，羅 揚，高鐘元，許 丹,3

( 1.上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海 201306； 2.上海海洋大學，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306； 3.上海海洋大學，國家漁業(yè)科學教育示范中心，上海 201306 )

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是一種實時監(jiān)控PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的定量方法，因其靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，目前已在基因表達檢測中廣泛應(yīng)用[1]。在常用的相對定量PCR試驗中，為準確獲得目的基因的相對表達量，通常引入合適的內(nèi)參基因來校正RNA質(zhì)量和反應(yīng)條件等存在的誤差。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同組織、不同發(fā)育階段和不同處理條件下均保持相對恒定的表達水平[2]。試驗中常選擇管家基因作為內(nèi)參基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白(β-actin)、18S核糖體RNA(18S rRNA)和延伸因子(EF-1α)。然而，有研究報道稱，絕對穩(wěn)定的基因并不存在，管家基因也只是在特定條件下表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的表達[3]，如鱖魚(Sinipercachuasti)胚胎發(fā)育階段β-actin、18S rRNA和GAPDH基因的穩(wěn)定性研究表明，18S rRNA在不同發(fā)育階段表達水平有顯著差異[4]。達氏鱘(Acipenserdabryanus)14種不同組織中EF-1α、β-actin和GAPDH基因的表達量研究表明，GAPDH基因表達有顯著差異[5]。因此，即便是管家基因也要在特定條件下進行特定分析。為了提高qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果準確性，通常需要根據(jù)試驗處理條件選擇合適的內(nèi)參基因。

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是以興國紅鯉(Cyprinuscarpiovar.singuonensis)為父本，天然雌核發(fā)育的方正銀鯽(C.auratusgibelio)為母本，經(jīng)人工授精和異精雌核發(fā)育而獲得的子代，因其生長迅速、適應(yīng)力強、肉質(zhì)鮮美且易于養(yǎng)殖，頗受人們喜愛[6]。據(jù)統(tǒng)計，目前，我國養(yǎng)殖的異育銀鯽產(chǎn)量超過3.0×107t，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有非常重要的地位[7-8]。但是近幾年來，大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖導致其病害問題日益嚴重[9]。其中由鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ，CyHV-2)引發(fā)的造血器官壞死癥導致異育銀鯽大規(guī)模死亡，這給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失[10]。目前，針對鯉皰疹病毒Ⅱ型引發(fā)異育銀鯽大規(guī)模死亡的致病機理還不是十分清楚。Lu等[11]為研究鯉皰疹病毒Ⅱ型的致病機理選取感染后的腎臟組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，利用qRT-PCR技術(shù)驗證并分析基因的表達情況；Xia等[12]為探究干擾素對造血器官壞死癥的防治作用，利用qRT-PCR技術(shù)研究干擾素相關(guān)基因的表達情況。然而利用qRT-PCR技術(shù)進行異育銀鯽內(nèi)參基因系統(tǒng)篩選的研究國內(nèi)外尚未見報道。在生物體中各組織均有其獨特的生理機能，研究基因在不同組織中的不同表達量，可為研究基因的功能提供參考[13]。據(jù)報道，異育銀鯽的腎臟和脾臟是鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒富集最主要的組織，篩選出感染腎臟和脾臟在不同時間點均較穩(wěn)定的內(nèi)參基因可以為研究病毒致病機理獲得最準確的基因表達結(jié)果[14]。魚類細胞系的構(gòu)建為魚類疾病的研究等提供強有力的基礎(chǔ)材料[15]。細胞水平qRT-PCR內(nèi)參基因的研究將為確?；虮磉_分析的準確性提供依據(jù)，從而為細胞水平探究致病機理奠定基礎(chǔ)。

筆者選用GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4個管家基因，利用內(nèi)參基因評估軟件geNorm[16]、Norm Finder[17]、Best Keeper[18]、Delta Ct[19]以及RefFinder[20]對這4個內(nèi)參基因分別在健康異育銀鯽的不同組織、鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟、脾臟以及尾鰭細胞在不同時間點進行內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析，并從異育銀鯽腎臟組織cDNA轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出差異表達的基因PIN1[21]在腎臟組織不同感染時間點，對4個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行驗證。最終自4個候選內(nèi)參基因中篩選出在健康異育銀鯽的不同組織、鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟、脾臟以及尾鰭細胞不同時間點均適用的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康異育銀鯽 [體長(10.1±0.2) cm，質(zhì)量(90.2±0.12) g] 購于江蘇四大家魚原種場，在上海海洋大學動物房(23±0.5) ℃暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間每日投喂顆粒飼料1次(投喂量為魚體質(zhì)量的3%)。經(jīng)過7 d的暫養(yǎng)，隨機分為5組進行腹腔注射鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒懸液(每組注射量為7×103.9±0.22pfu/mL)[22]，對照組注射1 mL磷酸緩沖鹽溶液。注射后，分別在0、6、12、24 h和120 h時間點取6尾魚，解剖取腦、脾臟、腎臟、肌肉、鰓、腸、肝臟和心臟組織塊，迅速放置于液氮中速凍后暫存于-80 ℃冰箱中。

本試驗的尾鰭細胞[22]和鯉皰疹病毒Ⅱ型由國家水生動物病原庫實驗室保存[23]。尾鰭細胞用規(guī)格為T75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)18瓶，傳代48 h(細胞融合度至80%～90%)，棄除原來培養(yǎng)基(10%FBS，M199培養(yǎng)基)，加入2 mL鯉皰疹病毒Ⅱ型病懸液(7×103.9±0.22pfu/mL)[22]，對照組加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液孵育2 h之后，注入8 mL新鮮培養(yǎng)基(2%FBS，M199培養(yǎng)基)，放置27 ℃培養(yǎng)箱。分別在0、1、2、3、4 d和5 d各時間點收集3瓶細胞，放置冰箱-80 ℃保存。

1.2 總RNA的提取和cDNA 的合成

健康異育銀鯽的不同組織、鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟、脾臟以及細胞不同時間點的總RNA均使用試劑盒TRIzol?Reagent (Thermo Scientific, 美國)提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用NanoDrop?2000c核酸分析儀(Thermo Scientific, 美國)檢測RNA的含量及純度，稀釋后保持其質(zhì)量濃度為500～1000 ng/μL。分別從不同處理條件下的樣品中取2 μg RNA，使用Recombinant DNase Ⅰ(RNase-free) (TaKaRa)操作進行去DNA處理，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存儲于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物來源

自異育銀鯽腎臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得GAPDH基因的部分序列，用Primer 5.0設(shè)計引物用于qRT-PCR(表1)。另外β-actin[24]、18S rRNA[25]、EF-1α[26]、PIN1[21]基因的引物序列來源于已發(fā)表的文章。

表1 4種候選內(nèi)參基因的引物信息

1.4 qRT-PCR試驗

qRT-PCR使用 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)按說明書操作。反應(yīng)在BIO RAD CFX96TMReal-Time System定量PCR儀完成，25 μL PCR擴增反應(yīng)體系: TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (2×) 12.5 μL，cDNA (<100 ng) 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，PCR Forward/Reverse Primer(10 μmol/L) 1 μL，每個樣品重復(fù)測定3次。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，共40個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗選用geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct對qRT-PCR產(chǎn)生的原始Ct值進行數(shù)據(jù)分析。運用Ref Finder對4種軟件的分析結(jié)果進行綜合排名，最終給出一個穩(wěn)定性排名。

1.6 內(nèi)參基因的驗證

取感染鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒的異育銀鯽在0、6 h和72 h時的腎臟組織提取RNA(每個時間點3個生物學重復(fù))，為使研究更能區(qū)分內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，選取已驗證在病毒感染不同時間點的腎臟組織表達差異較大的PIN1[21]基因為目的基因，分別以EF-1α、β-actin、18S rRNA和GAPDH為內(nèi)參基因，按照1.3中qRT-PCR試驗步驟進行操作，引物見表1。內(nèi)參基因驗證的相對表達量用平均值±標準誤來表示，使用SPSS 19.0進行單因素方差分析，P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 引物的特異性評估

cDNA初始模板質(zhì)量濃度控制在200 ng/μL，以10倍梯度稀釋的對數(shù)函數(shù)與循環(huán)閾值(Ct值)作標準曲線。計算擴增效率，r2變化為0.993～0.997。所有基因的溶解曲線均為明顯單一峰(圖1)，且樣品PCR重復(fù)性較好，表明引物特異性較好，不存在引物二聚體。

圖1 4對引物的熔解曲線

2.2 健康的異育銀鯽不同組織候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估

檢測健康異育銀鯽8種組織(腦、脾臟、腎臟、肌肉、鰓、腸、肝臟和心臟)中4個候選內(nèi)參基因的表達量，所得Ct值分布見圖2。不同組織中4個候選內(nèi)參基因的Ct值為7.45～26.27，其中GAPDH表達水平受組織影響差異較大，最大值和最小值相差10.17個循環(huán)。18S rRNA的Ct值變化較小，最大值和最小值相差2.18個循環(huán)。18S rRNA的表達Ct值過小，這可能是因為18S rRNA是一種核糖體RNA，約占RNA總量的80%，呈現(xiàn)高豐度表達[27-28]。EF-1α和β-actin在這8種組織中穩(wěn)定性較好，均穩(wěn)定在17～18個循環(huán)。

圖2 健康異育銀鯽的不同組織候選內(nèi)參基因Ct值分布

健康異育銀鯽的不同組織內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序結(jié)果顯示，Delta Ct不需要限定起始的總RNA的含量，可直接對同一處理條件下不同基因進行Ct值兩兩比較，獲得更精確的結(jié)果。Delta Ct對異育銀鯽的不同組織4個候選內(nèi)參基因的評估結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性排序為EF-1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。

BestKeepe主要通過內(nèi)參基因和目標基因表達量的配對相關(guān)系數(shù)、標準偏差和變異系數(shù)確定內(nèi)參基因。其分析結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性排序為β-actin>EF-1α>GAPDH>18S rRNA。

Normfinder通過一個群體計算不同候選基因得到穩(wěn)定值，這個數(shù)值越小基因則越穩(wěn)定。Normfinder的分析結(jié)果與Delta Ct和BestKeeper的分析結(jié)果幾乎相同，與Delta Ct的分析結(jié)果完全一致，各基因穩(wěn)定性排序為EF-1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。

geNorm與Normfinder算法類似，不同的是geNorm對候選內(nèi)參基因進行兩兩比對計算得到各基因geNorm穩(wěn)定值(亦稱M值)，并通過geNorm穩(wěn)定值對基因穩(wěn)定性進行排序，geNorm穩(wěn)定值越小，表達越穩(wěn)定。其分析結(jié)果表明，EF-1α 和β-actin在異育銀鯽的不同組織中的表達同樣較穩(wěn)定。由圖3可見，EF-1α和β-actin的geNorm穩(wěn)定值均為0.304。

Ref Finder是一種綜合分析的軟件可以根據(jù)每個軟件的排名分配適當?shù)臋?quán)重并計算其權(quán)重的幾何平均值為最終的總排名。其分析結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性排序為EF-1α>β-actin>18S rRNA>GAPDH。

綜合4種軟件(Ref Finder)分析結(jié)果，結(jié)合geNorm穩(wěn)定值以及4個內(nèi)參基因的表達量Ct值，確定EF-1α和β-actin為健康異育銀鯽的不同組織穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表2 健康異育銀鯽的不同組織內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序

圖3 健康異育銀鯽的不同組織geNorm穩(wěn)定值

2.3 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織在不同時間點候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估

檢測鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織在不同時間點(0、6、12、24、48 h和120 h)4個候選內(nèi)參基因的表達Ct值分布見圖4。4個候選內(nèi)參基因的Ct值為8.79～24.58，其中GAPDH表達水平受感染時間影響差異較大，最大值和最小值相差3.21個循環(huán)。18S rRNA的Ct值變化較小，最大值和最小值相差1.53個循環(huán)。18S rRNA在不同感染時間點的表達量都過高，GAPDH在不同感染時間點的表達量都較β-actin和EF-1α的表達量低。相對而言，β-actin和EF-1α在4個候選內(nèi)參基因中表達量較穩(wěn)定。

圖4 CyHV-2感染異育銀鯽腎臟組織不同時間點候選內(nèi)參基因Ct值分布

Delta Ct的分析結(jié)果與Normfinder的分析結(jié)果一致，為β-actin>18S rRNA>GAPDH>EF-1α。BestKeeper的分析結(jié)果與前者略有不同，為EF-1α>18S rRNA>β-actin>GAPDH。geNorm的分析結(jié)果表明，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織不同時間點18S rRNA和β-actin的表達穩(wěn)定性一致(表3)。18S rRNA和β-actin的geNorm穩(wěn)定值均為0.535(圖5)。由于18S rRNA的Ct值過小，容易在試驗中造成誤差[29]，所以綜合4種軟件分析結(jié)果，結(jié)合geNorm穩(wěn)定值以及4個內(nèi)參基因的表達Ct值，最終確定β-actin最穩(wěn)定。

表3 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織不同時間點內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序

圖5 CyHV-2感染異育銀鯽腎臟組織不同時間點geNorm穩(wěn)定值

2.4 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織在不同時間點候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估

檢測鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織在不同時間點(0、6、12、24、48 h和120 h)候選內(nèi)參基因的表達量Ct值分布見圖6。4個候選內(nèi)參基因的Ct值為9.63～31.34，其中18S rRNA表達水平受感染時間影響差異較大，最大值和最小值相差21.71個循環(huán)。GAPDH的Ct值變化較小，最大值和最小值相差6.04個循環(huán)，但GAPDH的表達量都較EF-1α和β-actin的表達低。而EF-1α和β-actin的表達量均穩(wěn)定在15～23。

圖6 CyHV-2感染異育銀鯽脾臟組織不同時間點候選內(nèi)參基因Ct值分布

Delta Ct的分析結(jié)果與geNorm的分析結(jié)果幾乎一致，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織不同時間點EF-1α和β-actin穩(wěn)定性較好。其中g(shù)eNorm的穩(wěn)定值結(jié)果顯示，EF-1α和β-actin的穩(wěn)定性相差不大(圖7)。與Delta Ct 和geNorm的分析結(jié)果不同，BestKeeper與Normfinder的分析結(jié)果表明，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織中EF-1α和GAPDH的表達相對較穩(wěn)定(表4)。綜合4種軟件分析結(jié)果，結(jié)合geNorm穩(wěn)定值以及4個候選內(nèi)參基因的表達Ct值，最終確定，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織不同時間點EF-1α相對比較穩(wěn)定。

圖7 CyHV-2感染異育銀鯽脾臟組織不同時間點geNorm穩(wěn)定值

表4 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽脾臟組織不同時間點內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序

2.5 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽尾鰭細胞在不同時間點候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估

檢測鯉皰疹病毒Ⅱ型感染尾鰭細胞不同時間點(0、1、2、3、4 d和5 d)，4個候選內(nèi)參基因的表達量Ct值分布見圖8。4個候選內(nèi)參基因的Ct值為7.39～36.54，其中GAPDH表達水平受感染時間影響差異較大，最大值和最小值相差4.67個循環(huán)。18S rRNA的Ct值變化較小，最大值和最小值相差2.98個循環(huán)。β-actin和EF-1α在細胞感染不同時間點的表達量Ct值均相對穩(wěn)定(圖9，表5)。

2.6 內(nèi)參基因的驗證

研究表明，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽腎臟組織過程中，隨著感染時間延長，病毒拷貝數(shù)逐漸升高，PIN1基因的mRNA表達量顯著下降[21]。為驗證測序結(jié)果的準確性，本次定量驗證中添加6 h的試驗組。經(jīng)過SPSS 19.0分析，試驗結(jié)果和腎臟組織轉(zhuǎn)錄組cDNA的測序結(jié)果(TPM值)見圖10。PIN1基因以GAPDH為內(nèi)參基因時，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0 h和72 h時的表達趨勢與測序結(jié)果不符；PIN1基因以18S rRNA為內(nèi)參基因，目的基因表達在0 h和72 h沒有顯著差異。相反，以β-actin和EF-1α為內(nèi)參基因時，PIN1基因在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0 h和72 h時的表達趨勢與測序結(jié)果一致，且差異極顯著(P<0.01)。隨著感染時間的增加，PIN1基因以β-actin基因為內(nèi)參分別在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0、6 h和72 h時相對表達量差異極顯著(P<0.01)。而PIN1基因以EF-1α基因為內(nèi)參在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織0 h和72 h時相對表達量差異極顯著(P<0.01)(圖11)，但在PIN1基因以EF-1α為內(nèi)參在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟組織6 h和72 h時相對表達量無極顯著差異(P>0.01)。因此，在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟組織中β-actin為其最佳的內(nèi)參基因。

圖8 CyHV-2感染GiCF細胞不同時間點候選內(nèi)參基因Ct值分布

圖9 CyHV-2感染GiCF細胞不同時間點geNorm 穩(wěn)定值

表5 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染細胞不同時間點內(nèi)參基因的穩(wěn)定排名情況

圖10 PIN1基因分別以4個候選內(nèi)參基因為內(nèi)參在腎臟中的表達量

圖11 PIN1在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫測序中的表達量

3 討 論

3.1 內(nèi)參基因在不同組織中穩(wěn)定性分析

為了使基因在qRT-PCR試驗中的相對表達結(jié)果更可靠，篩選最佳的內(nèi)參(管家)基因是必不可少的。研究水產(chǎn)動物常用的管家基因很多，18S rRNA、GAPDH、EF-1α和β-actin是4個較為常用的內(nèi)參基因。其中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是一種參與糖酵解和糖異生等循環(huán)過程的關(guān)鍵酶[30]；延伸因子(EF-1α)是參與蛋白質(zhì)翻譯的重要因子[31]；18S核糖體RNA(18S rRNA)是一類編碼核糖體小亞基RNA[32]；β-肌動蛋白(β-actin)是構(gòu)成細胞骨架的主要成分之一。然而不同物種、不同組織、不同發(fā)育時期以及不同處理條件，管家基因的穩(wěn)定性并不是一成不變的，如在褐牙鲆胚胎不同發(fā)育時期18S rRNA是其最合適的內(nèi)參基因[33]；鱖魚的不同組織中GAPDH為其內(nèi)參基因[34]。因此只有篩選出合適的內(nèi)參基因才能保證qRT-PCR試驗結(jié)果的準確性。

本試驗選取健康異育銀鯽的8種不同組織為研究對象，選擇EF-1α、GAPDH、18S rRNA和β-actin 4個候選管家基因，結(jié)合4種內(nèi)參基因分析軟件，geNorm穩(wěn)定值以及4個內(nèi)參基因的表達量Ct值，最終分析結(jié)果表明，β-actin和EF-1α基因為健康異育銀鯽的不同組織中最穩(wěn)定的基因。董捷[26]研究草魚(Ctenopharyngodonidella)不同組織基因表達豐度時，發(fā)現(xiàn)18S rRNA和β-actin是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；Olsvik等[35-36]比較了大西洋鮭(Salmosalar)不同組織中β-actin、RPS20和EF-1α的表達穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)EF-1α基因的表達最穩(wěn)定；茅華華等[37]發(fā)現(xiàn)斑鱧(Channamaculata)在成魚不同組織中β-actin基因最穩(wěn)定。健康異育銀鯽的不同組織內(nèi)參基因β-actin和EF-1α的穩(wěn)定性與上述研究都有相似之處。這可能因為不同的物種中管家基因的轉(zhuǎn)錄水平不同，但是其在特定組織的穩(wěn)定性可能存在一致性。在脊椎動物魚類和無脊椎動物貝類中，雖然不同的物種中β-actin和EF-1α基因表達量不同，如草魚[26]、鱸鯉(Percocyprispingi)[38]、鱖魚[4]、建鯉 (Cyprinuscarpiovar.jian)[39]、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[40]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[41]和三角帆蚌 (Hypriopsiscumingii)[42]，但是其仍然具有良好的穩(wěn)定性，這與本試驗中的結(jié)果一致，表明β-actin和EF-1α基因同樣可以作為魚類與海洋無脊椎動物的內(nèi)參基因。

3.2 內(nèi)參基因在病毒刺激下穩(wěn)定性分析

生物體通常都有自我保護的意識，在病毒刺激下會產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為研究病毒刺激下免疫基因的表達提供理論基礎(chǔ)。

Jorgensen等[43]用傳染性鮭魚貧血病毒(Infectioussalmonanemiavirus, ISAV)感染大西洋鮭和腎細胞發(fā)現(xiàn)感染不同時間點組織水平18S rRNA和EF-1α最穩(wěn)定，而細胞水平僅有18S rRNA最穩(wěn)定。與上述試驗結(jié)果類似的是本試驗用鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的脾臟組織不同時間點，EF-1α為其穩(wěn)定的內(nèi)參基因。不同的是本試驗選用鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟和尾鰭細胞不同時間點發(fā)現(xiàn)β-actin為其最穩(wěn)定的基因。這與Julin等[44]用傳染性胰腺壞死病毒(Infectiouspancrieaticnecrosisvirus, IPNV)感染大西洋鮭不同時間點，發(fā)現(xiàn)EF-1α和β-actin的穩(wěn)定性最高的結(jié)論相似。有研究表明，異育銀鯽的腎臟是鯉皰疹病毒Ⅱ型的主要復(fù)制點，脾臟是淋巴細胞移居和接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場所[9]。所以在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽的腎臟、脾臟不同時間點內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不同，這可能與病毒刺激條件下，基因在組織間的選擇性表達有關(guān)。此外本試驗由于18S rRNA的表達過于豐富，可能會比目的基因的表達還要高，容易在試驗過程中和數(shù)據(jù)分析時造成誤差，且有研究表明，18S rRNA的轉(zhuǎn)錄容易受到生物因素和藥物因素影響[29]。EF-1α是真核生物的延伸因子，其在組織中穩(wěn)定性已經(jīng)被大量的學者研究證明，如大鯢(Andriasdavidianus)在細菌的感染下組織的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價顯示，EF-1α是穩(wěn)定的內(nèi)參基因[45]。本試驗的結(jié)果分析也表明，EF-1α可作為病毒刺激下穩(wěn)定的內(nèi)參基因。β-actin是一種微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，在抵御某些病毒和病原微生物的入侵時，β-actin的分泌穩(wěn)定，可以用作為內(nèi)參基因?qū)ζ渌虻臉藴驶幚韀46]。因此，在病毒刺激下，β-actin較適合作為異育銀鯽腎臟組織和細胞水平qRT-PCR的內(nèi)參基因。

PIN1是一種高度保守的特異的多肽脯氨?；樂串悩?gòu)酶具有促進細胞增殖的功能[47]。數(shù)據(jù)庫測序結(jié)果顯示，PIN1基因表達量呈下調(diào)趨勢，本試驗的qRT-PCR結(jié)果也顯示，以β-actin為內(nèi)參時PIN1基因表達量符合測序結(jié)果。Lu等[22]在異育銀鯽腎臟組織的cDNA文庫測序過程中發(fā)現(xiàn)，PIN1基因表達量在感染魚體過程中呈現(xiàn)組織水平的下調(diào)趨勢與本試驗結(jié)果相符合，這可能在病毒的刺激下PIN1基因的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制從而導致細胞增殖的功能受阻。

4 結(jié) 論

本試驗通過qRT-PCR技術(shù)，篩選出異育銀鯽組織水平和細胞水平中均較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。試驗結(jié)果表明，在健康異育銀鯽的不同組織中β-actin和EF-1α均可作為其內(nèi)參基因。在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染腎臟以及細胞系不同時間點，β-actin為其內(nèi)參基因；脾臟組織中，EF-1α為其內(nèi)參基因。通過在異育銀鯽腎臟組織不同感染時間點，PIN1基因的表達分析也進一步驗證了其內(nèi)參基因的適用性，本研究將為探究異育銀鯽基因的qRT-PCR提供理論依據(jù)，為深入查明異育銀鯽體內(nèi)及體外宿主的基因表達與病毒相互作用奠定基礎(chǔ)。