代 亮，李曉東，李 藝，劉漢堤，曹 萌，鄭 巖，孫 娜

( 1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023； 2.盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心，遼寧省中華絨螯蟹育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧光合河蟹專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái)，企業(yè)工程技術(shù)研究中心，遼寧 盤錦 124200； 3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110866 )

2018年全國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量64 576 558 t，產(chǎn)值1.2815萬(wàn)億元，淡水產(chǎn)品總量約占總產(chǎn)量的48.9%，而淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量占淡水產(chǎn)品總量的93.8%，為29 598 384 t，是我國(guó)淡水產(chǎn)品的主要來(lái)源。在淡水養(yǎng)殖中，中華絨螯蟹產(chǎn)量756 877 t，產(chǎn)值約800億元，是淡水甲殼類養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)物種。與同為淡水甲殼類養(yǎng)殖重點(diǎn)的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)產(chǎn)量相近，但總產(chǎn)量不足淡水養(yǎng)殖魚類中草魚(Ctenopharyngodonidellus)的1/7(5 540 301 t)，而幾個(gè)養(yǎng)殖種類的產(chǎn)量主要靠池塘養(yǎng)殖獲得[1]。但從目前中華絨螯蟹的單位面積產(chǎn)量水平來(lái)分析，其占有的池塘水面資源要多于凡納濱對(duì)蝦和草魚[2-4]。中華絨螯蟹正面臨產(chǎn)量增長(zhǎng)瓶頸，在水資源和空間資源緊缺的情況下，中華絨螯蟹的種內(nèi)打斗行為已經(jīng)成為影響其成活率和單位面積產(chǎn)量的重要因子，解決其種內(nèi)打斗行為所帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)利益與生態(tài)效益可以預(yù)見(jiàn)。

影響中華絨螯蟹打斗行為的因素眾多[5-7]，魏鴻擎等[8]研究表明，水生動(dòng)物的攻擊行為受神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)控制。多巴胺是一種影響攻擊行為的重要神經(jīng)遞質(zhì)[9]，在人類社會(huì)中，社會(huì)排斥與社會(huì)接納是影響個(gè)體攻擊的重要因素，感到被排斥的個(gè)體會(huì)因憤怒而表現(xiàn)出敵意和攻擊行為[10]，而多巴胺功能系統(tǒng)較弱的人暴力行為增加[11]。哺乳動(dòng)物和昆蟲的攻擊行為受多種激素調(diào)節(jié)，多巴胺和五羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)是其中重要部分[12]。相關(guān)研究顯示，神經(jīng)酪氨酸激酶缺陷型的斑馬魚(Daniorerio)體內(nèi)單胺系統(tǒng)受到影響，具有更強(qiáng)烈的焦慮性，導(dǎo)致斑馬魚具有更強(qiáng)的攻擊性[13]。注射多巴胺后克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的游泳行為顯著增強(qiáng)[14]；Péqueux等[15]測(cè)定了中華絨螯蟹體內(nèi)各種神經(jīng)遞質(zhì)的含量，為注射和外源介入神經(jīng)遞質(zhì)提供了依據(jù)?？梢鸺讱?dòng)物生理調(diào)節(jié)的外源介入多巴胺劑量已有研究[16]。但是，多巴胺對(duì)1齡中華絨螯蟹打斗行為的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者研究了不同劑量多巴胺對(duì)1齡中華絨螯蟹打斗行為的統(tǒng)計(jì)學(xué)影響，量化分析了打斗行為的程度，統(tǒng)計(jì)分析了打斗時(shí)長(zhǎng)、打斗次數(shù)及勝負(fù)關(guān)系，以探索中華絨螯蟹打斗行為機(jī)制以及采用外源神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)控制中華絨螯蟹的打斗行為，降低打斗損失，提高養(yǎng)殖成活率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用中華絨螯蟹為盤錦光合蟹業(yè)有限公司選育的中華絨螯蟹新品種“光合1號(hào)”。選取100只規(guī)格相近、健康有活力的同一家系中1齡雄蟹，于30 cm直徑的白色塑料桶中暫養(yǎng)30 d。

暫養(yǎng)期間，每日18:00投喂試驗(yàn)蟹體質(zhì)量10%的人工配合飼料。投喂2 h后換水，暫養(yǎng)水體持續(xù)充氣。定期檢測(cè)水體pH(7～8)、溶解氧(≥2 mg/L)、鹽度(0～0.5)。暫養(yǎng)結(jié)束后，選取規(guī)格一致的中華絨螯蟹30只，體質(zhì)量(9±0.5) g，體長(zhǎng)(25±1.5) mm，體寬(27±1.5) mm，體高(12±0.6) mm，分成15組，每組2只。

1.2 方法

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)劑量組、1個(gè)對(duì)照組。將多巴胺鹽酸鹽(北京北納創(chuàng)聯(lián)，純度98%)分別溶解在無(wú)菌生理鹽水中至濃度為5×10-4mol/L、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L。將這3種濃度溶液按每只20 μL的劑量，迅速注射到中華絨螯蟹第三步足的動(dòng)脈膜中，分別達(dá)到10-8、10-7、10-6mol的量?？瞻讓?duì)照組注射20 μL生理鹽水。每組設(shè)3個(gè)平行。

1.2.1 打斗行為的觀察

將中華絨螯蟹用無(wú)毒、無(wú)味樹(shù)膠水彩標(biāo)記后，將其置于直徑20 cm、高40 cm(底部均勻鉆取12個(gè)孔洞，孔洞直徑為5 mm)的PE管中。PE管置于120 L水槽中，加水至水面高度30 cm(圖1)。底質(zhì)選取經(jīng)30目網(wǎng)袋過(guò)濾后的細(xì)沙，用高錳酸鉀消毒后，反復(fù)沖洗，均勻鋪于水槽中，厚度不超過(guò)中華絨螯蟹體厚。為避免水體環(huán)境變化引起中華絨螯蟹的應(yīng)激行為，用2個(gè)不透明燒杯將2只中華絨螯蟹分別倒扣在試驗(yàn)容器中，并置于PE管兩側(cè)1 h。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將燒杯取出，向中華絨螯蟹體內(nèi)注射預(yù)設(shè)劑量多巴胺，注射后用燒杯倒扣，并同時(shí)取出，開(kāi)始觀察記錄。利用閉路攝像頭記錄2只中華絨螯蟹打斗情況，記錄4 h內(nèi)的打斗時(shí)長(zhǎng)、打斗次數(shù)、打斗分?jǐn)?shù)及勝負(fù)關(guān)系等指標(biāo)。

1.2.2 抽取血淋巴

打斗試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，迅速用無(wú)菌1 mL注射器在蟹第三或第四步足基部對(duì)中華絨螯蟹及3只未進(jìn)行打斗試驗(yàn)的暫養(yǎng)蟹進(jìn)行血淋巴抽取。血淋巴樣品與1%檸檬酸鈉以1∶1比例混合，以1600 r/min離心10 min，所得血漿于-70 ℃保存。使用ELISA酶聯(lián)免疫法測(cè)定多巴胺含量[17]，所用試劑盒購(gòu)自上海朗頓生物科技有限公司。

圖1 打斗試驗(yàn)裝置

1.2.3 打斗強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

打斗強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[18]見(jiàn)表1。

1.2.4 勝負(fù)關(guān)系判定

初次打斗結(jié)束后逃跑一方，且在之后打斗行為中均呈現(xiàn)逃跑狀態(tài)，則判定為失敗方；另一方為勝利方。

1.2.5 樣本前處理

標(biāo)本采集后置于-20 ℃保存。檢測(cè)前放至室溫，血清自然凝固10～20 min，離心20 min(2000～3000 r/min)。仔細(xì)收集上清液，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

1.2.6 樣本檢測(cè)流程

準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品→加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素抗原，37 ℃反應(yīng)30 min→洗板5次，加入親和素-HRP，37 ℃反應(yīng)30 min→洗板5次，加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min→加入終止液→10 min之內(nèi)讀OD值→計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

T=∑ti

S=∑si

式中，T為打斗總時(shí)長(zhǎng)，S為打斗強(qiáng)度，i為打斗次數(shù)，t為每次打斗時(shí)長(zhǎng)，s為每次打斗得分。

表1 打斗強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

圖2 觸碰對(duì)手

圖3 推拉對(duì)手

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0、Excel 2010等軟件整理、處理，用Excel常規(guī)統(tǒng)計(jì)后，用SPSS進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及Duncan多重比較。顯著性水平為0.05。對(duì)注射不同劑量多巴胺情況下中華絨螯蟹的打斗時(shí)長(zhǎng)、打斗次數(shù)、打斗強(qiáng)度及勝負(fù)關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射不同劑量多巴胺中華絨螯蟹的打斗時(shí)長(zhǎng)

各劑量組中華絨螯蟹打斗時(shí)長(zhǎng)見(jiàn)表2。對(duì)試驗(yàn)組中華絨螯蟹打斗時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行分析后可知，不同劑量多巴胺對(duì)中華絨螯蟹打斗時(shí)長(zhǎng)影響極顯著(P<0.01)(圖4)。對(duì)照組打斗時(shí)間最長(zhǎng)，與注射組差異顯著(P<0.05)；注射組中，隨注射量的增加，打斗時(shí)長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，10-8mol組與其余各組差異顯著(P<0.05)；10-7mol組與10-6mol組差異不顯著(P>0.05)，與其余各組差異顯著(P<0.05)。對(duì)照組在第3 h階段時(shí)長(zhǎng)最高，10-6mol組在第2 h階段最高，其余各組均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖5)。

表2 各組中華絨螯蟹的打斗時(shí)長(zhǎng)

注：上標(biāo)不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，上標(biāo)相同字母的平均值間差異不顯著(P>0.05),下同.

圖4 各組中華絨螯蟹打斗時(shí)長(zhǎng)

2.2 注射不同劑量多巴胺的中華絨螯蟹的打斗強(qiáng)度

各劑量組中華絨螯蟹打斗強(qiáng)度見(jiàn)表3。對(duì)各劑量組中華絨螯蟹打斗強(qiáng)度進(jìn)行分析后可知，不同劑量多巴胺對(duì)中華絨螯蟹打斗強(qiáng)度影響極顯著(P<0.01)(圖6)。對(duì)照組打斗強(qiáng)度低于10-8mol組，高于其他注射組，且與注射組各濃度間差異顯著(P<0.05)。注射組中，隨注射多巴胺量升高，打斗強(qiáng)度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，10-8mol組打斗強(qiáng)度最高，各組間差異顯著(P<0.05)。對(duì)照組與10-8mol組打斗強(qiáng)度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，至第3 h階段達(dá)到最高，隨后下降；10-7mol組升至第2 h階段達(dá)到最高，隨后下降；10-6mol組升至第2 h階段達(dá)到最高，隨后降至第3 h階段后再次上升(圖7)。

圖5 各組4 h時(shí)中華絨螯蟹打斗時(shí)長(zhǎng)分布

表3 各組中華絨螯蟹打斗強(qiáng)度

圖6 各組中華絨螯蟹打斗強(qiáng)度

圖7 各組中華絨螯蟹打斗強(qiáng)度4 h分布

2.3 注射不同劑量多巴胺的中華絨螯蟹的打斗次數(shù)

各劑量組中華絨螯蟹打斗次數(shù)見(jiàn)表4。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，不同劑量多巴胺對(duì)中華絨螯蟹打斗次數(shù)影響極顯著(P<0.01)(圖8)。對(duì)照組與10-7mol組差異不顯著(P>0.05)，與其余各組差異顯著(P<0.05)。注射組中，隨注射量的增加，打斗次數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中，10-8mol組與其余各組差異顯著(P<0.05)；10-7mol組與10-6mol組差異不顯著(P>0.05)。由圖8可知，對(duì)照組隨時(shí)間延長(zhǎng)，打斗次數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；10-8mol組打斗次數(shù)在前3 h階段打斗次數(shù)相近，在第4 h階段呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；10-7mol組與10-6mol組在第1 h階段打斗次數(shù)較低，隨時(shí)間延長(zhǎng)打斗次數(shù)先升后降(圖9)。

表4 各組中華絨螯蟹打斗次數(shù)

圖8 各組中華絨螯蟹打斗次數(shù)

圖9 各組中華絨螯蟹4 h的打斗次數(shù)分布

2.4 注射不同劑量多巴胺中華絨螯蟹的體內(nèi)多巴胺的含量

打斗結(jié)束后，各劑量組勝負(fù)雙方體內(nèi)多巴胺含量見(jiàn)表5。勝負(fù)關(guān)系導(dǎo)致中華絨螯蟹體內(nèi)多巴胺含量不同(P<0.05)。勝利方體內(nèi)多巴胺含量顯著高于失敗方(P<0.05)，與正常水平多巴胺體內(nèi)含量差異不顯著(P>0.05)，正常水平多巴胺含量顯著高于失敗方(P<0.05)。各劑量組間多巴胺含量差異不顯著(P>0.05)(圖10)。

表5 打斗結(jié)束時(shí)各劑量組多巴胺含量 ng/mL

圖10 打斗結(jié)束后各劑量組多巴胺含量

3 討 論

3.1 注射多巴胺對(duì)中華絨螯蟹打斗行為的影響

神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)甲殼動(dòng)物打斗行為的影響研究表明，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)通過(guò)調(diào)節(jié)多巴胺的分解代謝調(diào)控三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的攻擊行為。多巴胺含量升高時(shí)，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因PtCOMT表達(dá)量增加，三疣梭子蟹攻擊行為增強(qiáng)[17]。中樞五羥色胺能系統(tǒng)抑制多巴胺的功能[19]。神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺能夠降低中華絨螯蟹互殘的殘肢率，提高成活率[20]；能抑制鋸緣青蟹(Scyllaserrata)打斗行為[21]；可促進(jìn)克氏原螯蝦的攻擊行為，當(dāng)與氟西汀共同注射時(shí)，攻擊行為減弱[22]。

本試驗(yàn)中，打斗時(shí)長(zhǎng)與打斗強(qiáng)度結(jié)合分析表明，對(duì)照組中華絨螯蟹的打斗行為傾向于長(zhǎng)時(shí)間、低強(qiáng)度的追逐攻擊，注射量為10-8mol時(shí)攻擊行為多呈現(xiàn)高強(qiáng)度、短時(shí)間的對(duì)螯、抱摔等攻擊行為。10-8mol組中華絨螯蟹打斗次數(shù)高于對(duì)照組，說(shuō)明在10-8mol劑量下，促進(jìn)了中華絨螯蟹的打斗次數(shù)與打斗行為。趙玉超等[23]給3種養(yǎng)殖對(duì)蝦注射多巴胺后，顯著促進(jìn)了對(duì)蝦的攻擊行為，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。有研究結(jié)果顯示，歐洲寄居蟹(Pagurusbernhardus)攻擊行為與體內(nèi)多巴胺水平呈正相關(guān)，隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，多巴胺水平下降時(shí)，攻擊行為減弱[24]。10-8mol組中華絨螯蟹的打斗行為主要集中在前3 h，第4 h明顯下降。打斗結(jié)束時(shí)，各注射組勝利方體內(nèi)多巴胺含量與正常水平的空白對(duì)照組相同，失敗方低于正常水平，其原因是由于中華絨螯蟹體內(nèi)多巴胺含量下降[25]，導(dǎo)致攻擊行為減弱。

當(dāng)多巴胺注射量達(dá)到10-7mol時(shí)，中華絨螯蟹打斗時(shí)長(zhǎng)和打斗強(qiáng)度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明該劑量下中華絨螯蟹多呈現(xiàn)短時(shí)間、低強(qiáng)度的追逐行為，10-7mol組的打斗次數(shù)與對(duì)照組差異不顯著。結(jié)果表明，注射量增加至10-7mol，中華絨螯蟹打斗次數(shù)未發(fā)生變化，但打斗強(qiáng)度得到抑制。當(dāng)注射劑量達(dá)到10-6mol時(shí)，打斗次數(shù)、打斗強(qiáng)度以及打斗時(shí)長(zhǎng)均顯著降低，中華絨螯蟹打斗頻率與打斗強(qiáng)度均得到抑制，且活動(dòng)能力減弱。Hoglund等[26]研究發(fā)現(xiàn)，口服多巴胺可使北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinusleucomaenis)的應(yīng)激誘導(dǎo)受到抑制，從而降低其攻擊行為。Martinez等[27]研究表明，注射多巴胺后，黑背蟹(Gecarcinuslateralis)的運(yùn)動(dòng)活性降低；當(dāng)同時(shí)注射多巴胺拮抗劑氟哌啶醇時(shí)，這種作用被阻斷。高劑量多巴胺會(huì)使爬行動(dòng)物產(chǎn)生惡心、眩暈等非特異性抑制，降低其攻擊行為[28]；亦會(huì)抑制鱖魚(Sinipercachuatsi)的攝食[29]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果分析，當(dāng)注射量升高時(shí)，多巴胺對(duì)中華絨螯蟹產(chǎn)生非特異性抑制，對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力產(chǎn)生影響，導(dǎo)致打斗行為下降。試驗(yàn)視頻顯示，10-7mol組與10-6mol組中的中華絨螯蟹，在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)呈現(xiàn)肢體舒張、靜止不動(dòng)的狀態(tài)，隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)此狀態(tài)逐漸緩解。打斗結(jié)束后，由于多巴胺代謝[23]，其抑制作用減弱，中華絨螯蟹運(yùn)動(dòng)能力得到增強(qiáng)。相關(guān)研究也表明，高劑量多巴胺會(huì)影響甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)，降低其代謝能力[30]。此劑量范圍是否影響中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)，降低其代謝能力，抑制打斗行為，有待進(jìn)一步研究。關(guān)于多巴胺在中華絨螯蟹體內(nèi)代謝時(shí)長(zhǎng)及其在打斗行為中作用機(jī)理亦需進(jìn)一步探討。

3.2 中華絨螯蟹打斗后的勝負(fù)關(guān)系與體內(nèi)多巴胺含量

分析打斗結(jié)束后，各組勝利方多巴胺含量高于失敗方。Sneddon等[31]研究結(jié)果表明，岸蟹(Carcinusmaenas)的打斗強(qiáng)度與打斗行為受到體內(nèi)多巴胺水平的影響。打斗結(jié)束后，獲勝者體內(nèi)多巴胺水平高于失敗者，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)打斗雙方勝負(fù)關(guān)系確立后，失敗方長(zhǎng)期處于逃避勝利方攻擊的狀態(tài)中，其攻擊行為顯著下降。相關(guān)研究表明[32]，多巴胺拮抗劑可以使勝負(fù)關(guān)系確立的勝利方小鼠攻擊行為下降，使勝利者效應(yīng)減弱；多巴胺作為一種獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制神經(jīng)遞質(zhì)，具有一定補(bǔ)償性，飽食狀態(tài)與長(zhǎng)期饑餓狀態(tài)的螺類多巴胺水平相近[33]；多巴胺作為一種補(bǔ)償性神經(jīng)遞質(zhì)參與縊蟶(Sinonovaculaconstricta)的損傷修復(fù)過(guò)程[34]。本試驗(yàn)中，中華絨螯蟹在打斗過(guò)程中，多巴胺作為一種獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制神經(jīng)遞質(zhì)[35]可使勝利方保持勝利者效應(yīng)，當(dāng)面對(duì)失敗方時(shí)，其打斗次數(shù)與打斗強(qiáng)度始終高于失敗方。多巴胺的補(bǔ)償作用抑制了中華絨螯蟹打斗損傷造成的攻擊行為弱化，導(dǎo)致勝利方的攻勢(shì)較失敗方更為強(qiáng)烈。在不利環(huán)境因素中，水生生物體內(nèi)多巴胺含量會(huì)減少，其個(gè)體生長(zhǎng)與攻擊行為隨之減弱[36]，打斗失敗后，在優(yōu)勢(shì)方不斷進(jìn)攻的情況下，失敗方處于不利環(huán)境因素中，其體內(nèi)多巴胺含量低于正常水平，導(dǎo)致其打斗行為顯著減弱[37]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，多巴胺注射劑量在10-8mol時(shí)，促進(jìn)了中華絨螯蟹打斗行為；隨著多巴胺注射劑量的增加，中華絨螯蟹打斗行為整體呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)。打斗結(jié)束后，勝利方體內(nèi)多巴胺水平高于失敗方，失敗方低于正常含量水平。