張 露 胡紅美 李鐵軍 徐開達 孫秀梅 應忠真 金衍健 楊承虎 郭遠明

（浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所 浙江省海洋水產(chǎn)研究所浙江省海洋樂漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室 浙江舟山316021）

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs），作為添加劑在塑料、聚乙烯樹脂等制造業(yè)中的大量使用及其釋放使得它們在環(huán)境中普遍存在，近年來備受關注[1]。報報道，在過去的幾十年里，世界PAEs 的產(chǎn)量從1975年的180 萬t 迅速增長到2011年的800 萬t[2]。大多數(shù)PAEs 不與母體基質共價結合，這使得它們的釋放更加頻繁[3-4]。研究表明PAEs甚至在低濃度時就能表現(xiàn)出內(nèi)分泌干擾作用或生殖毒性[5]。歐洲食品安全局規(guī)定鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、DEHP、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）每天攝入量限量分別為0.01，0.5，0.01，0.15，0.15 μg/kg，世界衛(wèi)生組織規(guī)定鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）的每天攝入量不超過500 μg/kg。

PAEs 通過廢水和河流輸入進入海洋，目前在各類海洋生物中也均有不同程度的檢出，從初級生產(chǎn)者（浮游生物和大型藻類）到尖吻角鯊，在食物網(wǎng)中并沒有觀察到生物放大效應[6]。Cheng 等[7]對香港市售的20 多種魚類進行檢測，PAEs 在淡水魚和海水魚中的含量分別為1.66～3.14 和1.57～7.10 μg/g。多數(shù)研究表明海產(chǎn)品中PAEs 濃度相對較低，然而，DEHP 在不同水平上均被檢測到[8]。對于海產(chǎn)品的檢測，提取和凈化是關鍵，尤其脂肪等雜質，在前處理時與親脂性PAEs 被共同萃取出來，在使用色譜分析方法【如氣相色譜-質譜法（GC-MS）或液相色譜-質譜法（LC-MS）】之前，還需要一些額外的前處理以除去脂肪。迄今為止，常用的PAEs 前處理方法，首先采用索氏提取[9]、加速溶劑萃取[10]、超聲波萃取[11-23]、微波萃取[24]等完成萃取，再通過凝膠滲透色譜[13,18-19]、固相萃取[11-12，14-17，19-21，24]、冷凍脫脂[13]、分散固相萃?。―SPE）[22，25-26]等對脂肪基質進一步凈化。DSPE 是Anastassiades 在2003年推出的QuEChERS 方法中必不可少的凈化步驟，因其簡單、高效而在食品、沉積物、土壤樣品前處理中應用[25-31]。基于實驗室前期工作[29-30]，本研究提出海產(chǎn)品中PAEs 檢測的DSPE 方法，并將該法用于舟山經(jīng)濟海產(chǎn)品的檢測，同時評估人體攝入海產(chǎn)品中PAEs 的健康風險，以期為PAEs 的風險管控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B/5977A 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司；Büchi R-215 旋蒸儀，瑞士步琦有限公司；EVA50A 氮吹儀，北京普立泰科儀器有限公司；SK8200GT 超聲波萃取儀，上?？茖С晝x器有限公司；Avanti JXN-30 series 低溫超高速離心機，美國貝克曼公司。

N-丙基乙二胺（PSA，40～63 μm）、弗羅里硅土（Florisil，60～100 目）、C18（40～63 μm）、石墨化炭黑（GCB，120～400 目）、硅膠（Si，40～46 μm）、中性氧化鋁（Alumina-N，100～300 目），購自上海安譜科學儀器有限公司。

PAEs 標準物質，德國Dr 公司。以正己烷為溶劑，通過逐級稀釋，配制成1 000 μg/L 的混標溶液，4℃貯存。正己烷（HEX）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EAC）、丙酮（ACE）、異丙醇（IPA）、乙腈（ACN）、甲醇（MT）等均為HPLC 級。

1.2 儀器工作條件

1）色譜條件 HP-35MS 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；不分流進樣，進樣口、傳輸線的溫度均為260 ℃；程序升溫，初始溫度100℃，以10 ℃/min 升至290 ℃（保持5.0 min）；高純He 作為載氣，流量1.0 mL/min。

2）質譜條件 電子轟擊離子源（EI），電離能量為70 eV，離子源、四級桿溫度分別為230，150℃；溶劑延遲3 min；選擇離子監(jiān)測，具體的定性、定量離子參考本實驗室前期建立的質譜條件[30]。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集、制樣和保存 所有海產(chǎn)品均購自舟山水產(chǎn)碼頭，樣品儲存和制備參考文獻[11]。具體制樣時，將魚類去鱗、去皮，取背部和腹部肌肉；甲殼類去殼、取肌肉；貝類去殼，取可食部分。將樣品切成小塊，高速攪碎機勻質后，-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品前處理 稱取2.00 g 樣品，置于玻璃離心管中，加入HEX∶DCM（1∶1，V/V）20 mL，渦旋3 min，超聲波提取15 min，根據(jù)需要加入Cu 粉（1～3 g）超聲脫硫，4 000 r/min 離心3 min，提取液經(jīng)無水Na2SO4脫水，再向樣品中加入HEX 20 mL，重復上述步驟，合并提取液，39 ℃旋轉蒸發(fā)至干，加入2 mL HEX 溶解，轉移至含200 mg GCB的玻璃離心管中，渦旋30 s，3 000 r/min 高速離心2 min，取上清液置于另一玻璃試管中，依次加入2 mL ACE、2 mL DCM、2 mL MT，重復上述渦旋離心過程，合并上清液，吹氮至干，用HEX 定容1 mL，取1 μL 進行GC-MS 分析。

1.4 健康風險評估

美國環(huán)保署（US EPA）將DEHP 歸類為可能的致癌物，對DEHP 同時評估致癌風險和非致癌風險。其它PAEs 只需計算非致癌風險。本研究采用美國環(huán)保署推薦的有毒有害物質風險評價模型進行定量評估，公式如下：

式中Cseafood——海產(chǎn)品中PAEs 測定含量,mg/kg；EDI——居民每日暴露量，μg/（kg·d）；CR——海產(chǎn)品日均攝入量，g/d；BW——居民體重，本研究成人、兒童體重分別以60 kg 和15 kg計[32-33]，海產(chǎn)品日均攝入量分別為142.2 g/d 和50 g/d[34-35]。

式中：HQ——有毒物質非致癌風險指數(shù)，當HQ ＞1 時存在健康風險，反之風險可接受；RfD——經(jīng)口暴露參考劑量，μg/（kg·d），DMP、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、DBP、BBP、DEHP 的RfD 分 別 為800，800，800，100，200，20 μg/（kg·d）[36]。

式中：R——致癌風險，當R＜1×10-6時無致癌風險，反之有一定的致癌風險。CSF——致癌斜率系數(shù)，DEHP 為0.014 [mg/（kgod）]-1[37]。

2 結果與討論

2.1 萃取劑的選擇

根據(jù)不同萃取劑的超聲波萃取效果（圖1），選用DCM 萃取2 次時，DMP、DIBP、DBP、鄰苯二甲酸二己酯（DNHP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、DNOP、鄰苯二甲酸二苯酯（DPhP）、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）的回收率較差（54%～68%）；選用HEX，DMP、DIBP、DBP、鄰苯二甲酸二甲氧基乙酯（DMEP）、鄰苯二甲酸二乙氧基乙基酯（DEEP）的回收率較差（48%～67%），而DNOP、DPhP、DNP 的回收率較好（75%～77%）；選用EAC，除DMP、鄰苯二甲酸二-4-甲基-2-戊基酯（BMPP）、DMEP、鄰苯二甲酸二正戊酯（DNPP）、DEHP 外，其它PAEs 回收率較差（47%～68%）；選用HEX∶EAC（1∶1，V/V），DMP、DBP、DPhP 回收率略差（62%～69%）；選用HEX∶DCM（1∶1，V/V），DNOP 回收率略差（68%）；同時選用HEX∶DCM（1∶1，V/V）、HEX 各萃取1 次，16 種PAEs 回收率在72%～103%，萃取效果令人滿意，為本研究優(yōu)選。

圖1 不同的萃取劑萃取效果對比Fig.1 Comparison of extract efficiency by different extractamts

2.2 固相吸附劑的選擇

脂肪和色素是干擾海產(chǎn)品檢測的關鍵因素，最常用的是固相萃取和凝膠滲透色譜凈化，然而這兩種方法溶劑用量較大，步驟較多。而用DSPE方法凈化水產(chǎn)品[22，25-26]中PAEs，使用PSA 作為吸附劑，對色素較多的水產(chǎn)品的吸附效果不佳，且僅用乙腈[22]或異丙醇[25-26]作為分散劑，檢測靈敏度較差，甚至市售水產(chǎn)品中具有普遍檢出特性的DEHP 也為未檢出[25-26]。

本研究對比了200 mg 的Florisil、PSA、GCB、C18、Si、Alumina-N 等吸附劑的除雜效果（圖2和圖3），結果表明，各吸附劑對色素的吸附能力依次為GCB＞Florisil＞Si＞PSA＞C18＞Alumina-N。選用GCB，分散液基本無色透明，且回收率較高（73%～107%）。其它吸附劑對某些PAEs 有不同程度的吸附，如C18 對BMPP、DMEP、BBP、DCHP、DNP 略有吸附（回收率61%～66%）。PSA 對DPhP 吸附較強（回收率僅33%）。Si、Florisil 對DMEP 均有一定吸附（回收率分別為37%和66%），且凈化后仍有雜質干擾DEEP 檢測。最終，本研究選擇GCB 作為吸附劑。

圖2 不同的吸附劑對PAEs 凈化效果對比Fig.2 Comparison of purifying effect of PAEs by different adsorbents

圖3 不同的吸附劑凈化時總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatograms purified by different adsorbents

2.3 分散劑的選擇

根據(jù)文獻報道，對于水產(chǎn)品[22，25-26]或土壤[31]，僅用單一分散劑回收率較差。對比GCB 在各種分散劑中的吸附效果（圖4）。結果表明，選用HEX，僅對DMEP、DBEP、DPhP 有較強的吸附；使用ACE，對DPhP 相比吸附較弱；使用DCM，對DEEP 基本無吸附；使用MT，對DMEP、BBP、DBEP、DNOP 相比吸附較弱；而IPA、EAC、ACN 對于絕大多數(shù)PAEs 均有一定的吸附，這可能是由于不同PAEs在不同的分散劑和吸附劑間的分配系數(shù)有所不同。最終依次選用2 mL HEX、2 mL ACE、2 mL DCM、2 mL MT 作為分散劑。

圖4 GCB 在不同的分散劑中對PAEs 吸附的影響Fig.4 Adsorption effect of PAEs by GCB in different dispersants

2.4 線性范圍、檢出限、精密度、準確度

配制質量濃度范圍為1～1 000 μg/L 的PAEs混標溶液進行測定，所有PAEs 的相關系數(shù)在0.9992～0.9998 范圍，具有較好的線性關系。按照3 倍 信 噪 比，DMP、DEP、DIBP、DBP、DNPP、DNHP檢出限為0.15 μg/kg，BMPP、BBP、DEHP、DCHP 為2.0 μg/kg，DBEP 為0.3 μg/kg，其它PAEs 為0.25 μg/kg。

對梅童魚樣品進行低、中、高3 個梯度水平的加標回收試驗，回收率、相對標準偏差分別為73%～117%和2.8%～7.5%，分析結果準確度、精密度符合方法要求（表1）。

表1 精密度、回收試驗結果（n=5）Table1 Results of test for precision and recovery（n=5）

2.5 樣品分析及健康風險評估

對采集的舟山市售海產(chǎn)品進行檢測，結果顯示，∑PAEs 含量為80.0～438 μg/kg；DEHP、DEP、DMP、DBP、DIBP 在所有樣品中均有檢出，含量為0.49～189 μg/kg，占∑PAEs 的89%～100%。此外，從部分樣品中也檢出DMEP、鄰苯二甲酸二丁氧基乙基酯（DBEP）、DCHP、DNP。不同種類海產(chǎn)品中PAEs 組分特征如圖5所示，DIBP、DBP、DEHP占比最高，占∑PAEs 的83.01%～94.18%。經(jīng)SPSS19.0 方差分析檢驗，不同海產(chǎn)品中PAEs 含量無顯著性差異。

DEHP 具有潛在致癌性，根據(jù)1.4 節(jié)的計算公式，魚類對成人的致癌風險指數(shù)范圍為2.0×10-6（梅童魚）～4.8×10-6（龍頭魚），均值3.4×10-6；對兒童為2.9×10-6（梅童魚）～6.8×10-6（龍頭魚），均值4.8×10-6。甲殼類對成人致癌風險指數(shù)范圍為1.3×10-6（哈氏仿對蝦）～3.2×10-6（青蟹），均值2.3×10-6；對兒童為1.9×10-6（哈氏仿對蝦）～4.5×10-6（青蟹），均值3.3×10-6。貝類、頭足類（魷魚）對成人致癌風險指數(shù)分別為2.4×10-6（菲律賓蛤仔）、1.2×10-6（魷魚），對兒童分別為3.4×10-6（菲律賓蛤仔）、1.6×10-6（魷魚）。所有樣品的致癌風險指數(shù)都在10-6數(shù)據(jù)級，成人風險略低于兒童。根據(jù)世界各國制定的可接受風險推薦值，一般認為致癌風險在1×10-6～1×10-4范圍內(nèi)是可以接受的，仍存在潛在致癌風險。對于B2 類致癌物質，常將1×10-5作為致癌風險的控制標準。本研究所有樣品致癌風險雖＞1×10-6，但＜1×10-5，總體上致癌風險較小。

隨后，對非致癌風險進行計算，結果見圖6，成人、兒童攝入DEHP、DBP、DIBP、DEP、DMP 的非致癌風險指數(shù)為10-5～10-2數(shù)量級，均遠遠＜1。從單組分看，所有樣品非致癌風險均可接受，對人體健康危害較小。與致癌風險相同，PAEs 對成人的非致癌風險略低于兒童。假設多組分共存時不產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用，將5 種PAEs 的非致癌風險指數(shù)簡單相加作為總非致癌風險指數(shù)，成人、兒童的總非致癌風險分別為4.5×10-3～1.9×10-2（平均值1.9×10-2）和6.4×10-3～2.7×10-2（平均值為1.5×10-2），總非致癌風險也可接受，這與石鳳瓊等[38]報道的廣東沿海海洋生物體中PAEs 健康風險基本處于同一個水平。DEHP、DBP、DIBP、DEP、DMP 的非致癌風險依次降低，其中DEHP、DBP 對非致癌風險指數(shù)的平均貢獻分別為85.90%和11.44%。

圖5 不同種類海產(chǎn)品中PAEs 組分特征Fig.5 PAEs composition in different types of seafood

圖6 不同海產(chǎn)品中PAEs 非致癌健康危害Fig.6 Non-cancer risk of PAEs in different seafood

3 結論

采用GC-MS 法檢測海產(chǎn)品中的PAEs，優(yōu)化了萃取條件和DSPE 凈化條件。樣品完成萃取后，提取液經(jīng)200 mg GCB 分散固相萃取便能達到很好的凈化效果，可進一步在淡水產(chǎn)品檢測中推廣應用。健康風險評估表明，所測海產(chǎn)品中PAEs 的健康風險在可接受范圍內(nèi)，PAEs 對成人的健康風險略低于兒童。