鄧婷婷 黃文勝 葛毅強(qiáng) 陳 穎*

（1 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京100176 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 3 科技部中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 北京100045）

目前世界各國(guó)出于經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生、環(huán)保等各種目的，紛紛對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品加強(qiáng)管理和檢測(cè)。包括中國(guó)在內(nèi)的50 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼頒布并實(shí)行了“轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度”，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)和管理。近年來(lái)，隨著各國(guó)有關(guān)轉(zhuǎn)基因生物（Genetically Modified Organism，GMO）標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對(duì)食品中的GMO 含量下限有所規(guī)定。很多國(guó)家不但要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行定性檢測(cè)，還要對(duì)食品中的GMO 含量進(jìn)行定量檢測(cè)，以便標(biāo)識(shí)，其標(biāo)識(shí)的閾值一般在0.9%～5%之間[1-4]。而建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)尤其是精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)是實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的技術(shù)前提。轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量技術(shù)將隨著全世界標(biāo)識(shí)制度的完善和發(fā)展日趨重要。

我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻研究處于國(guó)際領(lǐng)先水平，由我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻Bt 汕優(yōu)63 品系是采用基因槍法將人工合成的Bt 基因cry1Ac/cry1Ab 導(dǎo)入受體水稻明恢63 基因組中經(jīng)多代選育出來(lái)的，經(jīng)抗蟲(chóng)試驗(yàn)，其防蟲(chóng)效果在95%以上[5-6]。2009年，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻Bt 汕優(yōu)63（TT51-1）雖獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的湖北省安全生產(chǎn)證書[7]，但尚未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化種植，因此在大米及其制品的日常檢測(cè)和出入境檢測(cè)監(jiān)管中，該品系是我國(guó)重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象之一，需要建立轉(zhuǎn)基因大米及其制品的轉(zhuǎn)基因成分精準(zhǔn)檢測(cè)方法。轉(zhuǎn)基因大米種類及其遺傳修飾的多樣性使得其檢測(cè)變得越來(lái)越困難，其定量檢測(cè)的要求也越來(lái)越高。隨著國(guó)內(nèi)外檢測(cè)分析水平的提高，轉(zhuǎn)基因大米及其制品的檢測(cè)方法也將從最初定性分析逐漸轉(zhuǎn)為精準(zhǔn)定量分析。作為具有商業(yè)化前景的轉(zhuǎn)基因大米品系TT51-1，目前的定量分析仍采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，該方法需要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因含量，標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的核酸提取質(zhì)量以及PCR 擴(kuò)增效率等均會(huì)對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生影響，很難達(dá)到較高的精確度，尤其是轉(zhuǎn)基因成分含量低于1%水平時(shí)[6，8-9]，難以滿足國(guó)際最低標(biāo)識(shí)閾值0.1%[1]的檢測(cè)需求。

數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）是在實(shí)時(shí)熒光PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的微量DNA分子定量技術(shù)。1999年由Vogelstein 和Kinzler 首次提出數(shù)字PCR 的概念[10]。如今的數(shù)字PCR 技術(shù)借助微流體平臺(tái)將樣本分成大量（數(shù)百，數(shù)千甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)）微反應(yīng)室，每個(gè)微反應(yīng)室單獨(dú)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，再判定各個(gè)終產(chǎn)物的陰陽(yáng)性。根據(jù)泊松分布原理來(lái)計(jì)算初始模板濃度[11]。由于數(shù)字PCR 不需要校準(zhǔn)物，能準(zhǔn)確測(cè)量低拷貝的DNA 分子，使得它成為有效的核酸精準(zhǔn)定量工具，在醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如識(shí)別基因拷貝數(shù)的變異，低拷貝數(shù)核酸分子的檢測(cè)，DNA 質(zhì)量分析或檢查單細(xì)胞水平的基因表達(dá)等[12-19]。目前有報(bào)道將數(shù)字PCR 技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因作物精準(zhǔn)定量檢測(cè)中[20]。Corbisier 等[21]最先將數(shù)字PCR 方法應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因成分的定量中，該研究將轉(zhuǎn)基因玉米Mon810 的數(shù)字PCR 定量結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果相比較，定量結(jié)果較為一致。Burns 等[13]采用已驗(yàn)證的實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系，評(píng)估數(shù)字PCR技術(shù)的絕對(duì)檢測(cè)限和定量限，也闡述了采用梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)的方式可使數(shù)字PCR 更精確地測(cè)量拷貝數(shù)。Fu 等[22]利用數(shù)字PCR 對(duì)MON810 等多品系轉(zhuǎn)基因作物的CaMV35s 啟動(dòng)子和NOS 終止子進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明其定量檢測(cè)限為0.1%。Dobnik 等[23]利用微滴式數(shù)字PCR 方法分別建立兩個(gè)多重定量方法，可對(duì)12 個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行含量測(cè)定，其檢出限、重復(fù)性和真實(shí)性均符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中GMO 定量要求。其它研究也證明數(shù)字PCR可定量分析玉米、大豆、油菜及煙草等作物中的轉(zhuǎn)基因成分，這些研究結(jié)果均表明數(shù)字PCR 定量方法靈敏度高，準(zhǔn)確度高于實(shí)時(shí)熒光PCR 方法[24-28]。

本研究以轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)大米（Oryza sativa L.）TT51-1 品系為研究對(duì)象，建立基于大米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS 和TT51-1 品系特異性基因的轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 數(shù)字PCR 定量檢測(cè)方法，并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大米及米制品檢測(cè)中，以期為相關(guān)部門提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大米LL62 標(biāo)準(zhǔn)樣品、轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready 標(biāo)準(zhǔn)樣品、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11 標(biāo)準(zhǔn)樣品，歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所及美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)；TT51-1、KF6、M12、克螟稻等轉(zhuǎn)基因大米樣品、野生型大米明恢63（非轉(zhuǎn)基因）及其它實(shí)驗(yàn)樣品均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2×微滴式數(shù)字PCR 預(yù)混液、微滴生成槽、微滴生成油等，美國(guó)Bio-Rad 公司；2×Taq PCR MasterMix，美國(guó)ABI 公司；食品基因組提取試劑盒NucleoSpinRFood，美國(guó)MN 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微滴式數(shù)字PCR 儀QX200 系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；實(shí)時(shí)熒光PCR 儀7500，美國(guó)ABI 公司；Qubit 核酸蛋白分析儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；樣品研磨機(jī)，德國(guó)IKA 公司；離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取 分別將各種樣品材料研磨至60 目粒度，按照食品基因組提取試劑盒NucleoSpinRFood 說(shuō)明書進(jìn)行DNA 提取并利用Qubit 核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度。

1.3.2 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成 為篩選適用于轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 數(shù)字PCR 定量的引物探針，根據(jù)大米蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose phosphate synthase，SPS）和轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 品系外源插入片段與大米基因組3’端交界處的序列，設(shè)計(jì)3對(duì)SPS 基因引物探針和2 對(duì)TT51-1 品系特異性基因的引物探針，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成和標(biāo)記（表1）。

1.3.3 擴(kuò)增體系和反應(yīng)參數(shù) 數(shù)字PCR 擴(kuò)增體系：2×微滴式數(shù)字PCR 預(yù)混液10 μL，SPS 及TT51-1 基因正、反向引物各1 μL（終濃度0.32 μmol/L），SPS 基因探針0.5 μL（終濃度0.12 μmol/L），TT51-1 基因探針0.5 μL（終濃度0.2 μmol/L），DNA 模板5μL。

數(shù)字PCR 反應(yīng)參數(shù)：按上述體系配制好的數(shù)字PCR 反應(yīng)混合液，加入微滴生成槽的加樣孔中，在其另一側(cè)加入微滴生成油后放入QX 200TM微滴生成器中，由儀器按固定程序生成微滴。將生成的微滴移至PCR 擴(kuò)增板中進(jìn)行加膜密封后放入普通PCR 儀，擴(kuò)增程序：95 ℃，5 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，60 個(gè)循環(huán)；98 ℃10 min，1 個(gè)循環(huán)；12 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物放入微滴讀取儀中進(jìn)行熒光檢測(cè)和陰陽(yáng)性微滴數(shù)的讀取，采用Quantasoft 分析軟件（美國(guó)Bio-Rad 公司）自動(dòng)計(jì)算數(shù)字PCR 反應(yīng)體系中的SPS 和TT51-1 轉(zhuǎn)化體特異性基因的含量（copies/μL），再根據(jù)二者的比值計(jì)算得到樣品中TT51-1 轉(zhuǎn)基因成分含量（%）。

表1 SPS 和TT51-1 基因引物探針序列表Table1 The sequence of primers and probes of SPS and TT51-1

實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增體系：2×Taq PCR 預(yù)混液10 μL，SPS 或TT51-1 基因正、反向引物各1μL（終濃度0.4 μmol/L），SPS 或TT51-1 基因探針0.5 μL（終濃度0.2 μmol/L），DNA 模板5 μL，利用ddH2O 補(bǔ)至20 μL。

實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃，10 min；95℃，10 s，60 ℃，45 s，45 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 引物探針有效性和特異性 以轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 品系為擴(kuò)增模板，非轉(zhuǎn)基因大米明恢63和ddH2O 為對(duì)照，對(duì)SPS 基因的3 組引物探針和TT51-1 品系特異性基因的兩組引物探針進(jìn)行有效性擴(kuò)增。分別選取SPS 和TT51-1 品系特異性基因擴(kuò)增效率最高的引物探針組后，以非轉(zhuǎn)基因大米明恢63、轉(zhuǎn)基因大米TT51-1、KF6、KMD、LL62品系常見(jiàn)作物大豆、玉米、小麥、高粱、油菜為模板，ddH2O 為空白對(duì)照，對(duì)SPS-F2/R2/P2 引物探針組的特異性進(jìn)行分析。以100% TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米、1% TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米、非轉(zhuǎn)基因大米明恢63、轉(zhuǎn)基因克螟稻、KF6、M12、LL62、轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11 為模板，ddH2O 為空白對(duì)照，對(duì)TT51-F2/R2/P2 引物探針組的特異性進(jìn)行分析。

1.3.5 TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米定量的絕對(duì)靈敏度和相對(duì)靈敏度 將轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 DNA 溶液測(cè)定濃度進(jìn)行2 倍梯度稀釋，直至內(nèi)、外源基因含量均為2 copies/μL，即分別稀釋至3 pg 及1 pg（大米單個(gè)基因組質(zhì)量約為0.5 pg）。共稀釋4 個(gè)梯度，每個(gè)梯度4 個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)行內(nèi)源基因SPS 和外源基因TT51-1 的雙重?cái)?shù)字PCR 檢測(cè)。根據(jù)內(nèi)、外源基因的定量值（數(shù)字PCR 測(cè)得的基因含量）和理論值（根據(jù)Qubit 核酸蛋白分析儀測(cè)得的DNA 濃度計(jì)算出的基因含量）繪制相關(guān)性曲線。

利用上述試驗(yàn)建立的雙重?cái)?shù)字PCR 定量體系，對(duì)非轉(zhuǎn)基因大米及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%，1%，10%的轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 樣品的內(nèi)、外源基因分別進(jìn)行定量檢測(cè)（3 次重復(fù)），根據(jù)儀器通過(guò)泊松分布原理計(jì)算出的內(nèi)、外源基因含量（copies/μL），獲得各樣品的實(shí)際含量。

1.3.6 TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米數(shù)字PCR 定量方法的精密度和重復(fù)性 針對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.1%，1%的TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米樣品開(kāi)展轉(zhuǎn)基因成分定量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，共設(shè)置6 個(gè)平行。根據(jù)內(nèi)、外源基因拷貝數(shù)計(jì)算其SD、RSD 及相對(duì)偏差。

1.3.7 TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米實(shí)時(shí)熒光PCR 方法定量結(jié)果 根據(jù)TT51-1 轉(zhuǎn)基因成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，10%，5%，0.5%及0.1%的標(biāo)準(zhǔn)樣品制作內(nèi)、外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，1%，10%的轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 樣品DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增并定量分析，與數(shù)字PCR 定量結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.8 方法驗(yàn)證 在相同的測(cè)試環(huán)境和驗(yàn)證方法下，基于芯片式數(shù)字PCR 平臺(tái)，兩位試驗(yàn)操作人員做兩組平行試驗(yàn)。每個(gè)樣品設(shè)3 次重復(fù)，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.5%，1%，5%的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行芯片式數(shù)字PCR 定量研究。針對(duì)擴(kuò)增微反應(yīng)體系的分布情況，內(nèi)、外源基因的定量拷貝數(shù)等逐一進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的有效性和特異性分析

所有SPS 和TT51-1 基因引物探針組的實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明，SPS 基因的3 組引物探針和TT51-1 品系特異性基因的兩組引物探針均能有效擴(kuò)增出各自對(duì)應(yīng)的靶基因，SPS 基因F2/R2/P2 引物探針組和TT51-1 基因RB-F2/R2/P2引物探針組信號(hào)最強(qiáng)（圖1）。

圖1 SPS 及TT51-1 品系特異性基因各組引物探針篩選圖Fig.1 The effectiveness of the primers and probes of SPS and TT51-1 event-specific genes

為保證后續(xù)數(shù)字PCR 反應(yīng)能到達(dá)最大效率，選取SPS-F2/R2/P2 和TT51-F2/R2/P2 兩組引物探針，對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。SPS-F2/R2/P2 引物探針組僅能擴(kuò)增出大米成分，對(duì)其它禾本科植物玉米、小麥及大豆、玉米等作物均無(wú)擴(kuò)增。TT51-F2/R2/P2 引物探針組僅能擴(kuò)增出TT51-1 轉(zhuǎn)基因成分，其它轉(zhuǎn)基因大米克螟稻、KF6、M12、LL62，轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、陰性對(duì)照（非轉(zhuǎn)基因大米明恢63）和空白對(duì)照（ddH2O）均無(wú)擴(kuò)增（圖2），即SPS-F2/R2/P2 和TT51-F2/R2/P2 引物探針組只能分別擴(kuò)增大米和轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 成分，其特異性均較好。

2.2 TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米品系定量絕對(duì)靈敏度

在所有稀釋梯度中，SPS 和TT51-1 基因定量體系的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別在0.63%～2.62%和0.96%～3.62%之間，所有稀釋梯度的RSD 值均遠(yuǎn)小于25%，符合目前最嚴(yán)格的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和歐盟定量方法要求[30-31]。其內(nèi)、外源基因稀釋梯度曲線的R2分別為0.9998和0.9995，遠(yuǎn)高于實(shí)時(shí)熒光PCR 定量要求的中0.98[31]，該體系所檢測(cè)的濃度梯度均具有很好的線性關(guān)系（圖3a）。由于TT51-1 是母本非轉(zhuǎn)基因水稻和父本轉(zhuǎn)基因水稻華恢1 號(hào)純合子雜交產(chǎn)生的雜合子（F1 代），其米粒（胚乳）中含有2 倍的母本基因組和1 倍的父本基因組，因此SPS/TT51-1 基因之比的理論值應(yīng)為0.33。而實(shí)際結(jié)果中，SPS/TT51-1 基因拷貝數(shù)的比值在0.31～0.36 之間，其相對(duì)誤差在6%～9%之間（圖3b），即大米基因組在2～2 000 copies/μL 范圍時(shí)，定量的結(jié)果與理論值相符，該檢測(cè)體系能夠?qū)康椭? copies/μL 的轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

圖2 SPS-F2/R2/P2 及TT51-F2/R2/P2 引物探針組特異性擴(kuò)增圖Fig.2 The specificity of primers and probes of SPS-F2/R2/P2 and TT51-F2/R2/P2

圖3 TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米品系定量檢測(cè)線性關(guān)系及其絕對(duì)定量靈敏度Fig.3 Linear relationship and absolute sensitivity of quantitative detection of GM rice event TT51-1

2.3 TT51-1 轉(zhuǎn)基因大米數(shù)字PCR 定量方法的精密度和重復(fù)性

為了測(cè)試方法的精密度，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和1%的樣品進(jìn)行數(shù)字PCR 擴(kuò)增。含量為0.1%的6 個(gè)TT51 大米平行樣品的定量結(jié)果分別為（0.098%±0.0073）%，（0.102±0.0093）%，（0.110±0.006）5%，（0.102±0.0027）%，（0.091 ±0.0043）%，（0.108±0.0034）%，所有樣品的3 次重復(fù)RSD 在7.30%～18.63%之間，與理論含量值的偏差在-8.77%～9.62%之間。含量為1%的6 個(gè)TT51大米平行樣品的定量結(jié)果分別為（1.111±0.034）%，（0.957 ± 0.051）%，（1.143 ± 0.016）%，（0.922 ±0.012）%，（1.090±0.047）%，（0.987±0.054）%，所有樣品的3 次重復(fù)RSD 在3.66%～7.98%之間，與理論含量值的偏差在-7.84%～14.28%之間。兩種低含量的TT51 大米樣品的相對(duì)偏差和RSD 值均遠(yuǎn)小于常規(guī)定量要求的25%，表明該方法即使在對(duì)低含量的樣品進(jìn)行重復(fù)定量時(shí)，其精密度和穩(wěn)定性均較為理想。在樣品配制時(shí)，只要保證混合均勻，即使GM 成分含量較低，也能利用數(shù)字PCR方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量（圖4）。

圖4 TT51-1 樣品6 次重復(fù)定量結(jié)果Fig.4 Quantitative results of 6 replicates of GM rice TT51-1

2.4 轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 數(shù)字PCR 與實(shí)時(shí)熒光PCR 方法定量結(jié)果比較

分別以數(shù)字PCR 與實(shí)時(shí)熒光PCR 方法對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和1%、10%的轉(zhuǎn)基因大米TT51-1樣品進(jìn)行定量。數(shù)字PCR 定量結(jié)果中各樣品TT51-1 含量分別為（0.122±0.0043）%，（0.996±0.0303）%和（9.954 ± 0.1067）%，其與實(shí)際值的偏差分別為-1.31%，-2.95%，21.26%。各樣品多次重復(fù)試驗(yàn)中，1%，10%樣品的RSD 值均小于5%，0.1% RSD 值也符合要求，表明本研究建立的微滴式數(shù)字PCR 定量方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 的定量靈敏度達(dá)0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），其定量準(zhǔn)確性和精密度符合國(guó)際通用要求（表2）。

實(shí)時(shí)熒光PCR 定量分析中，當(dāng)內(nèi)、外源基因PCR 擴(kuò)增效率分別為97.16%和102.35%，內(nèi)、外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2都在0.99 以上，且各樣品內(nèi)、外源基因的3 次重復(fù)RSD 值在1.08%～18.32%之間時(shí)，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)定量值分別為（0.130±0.0022）%，（1.255±0.0229）%，（9.917±0.1630）%，其與實(shí)際值的偏差分別達(dá)到-0.83%，25.45%，29.77%（表2）。

實(shí)時(shí)熒光PCR 方法繪制的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性及內(nèi)、外源基因的PCR 擴(kuò)增效率符合要求，當(dāng)目標(biāo)樣品含量為10%時(shí)，定量結(jié)果較為準(zhǔn)確，而當(dāng)樣品含量低至1%時(shí)，定量結(jié)果出現(xiàn)偏差。數(shù)字PCR 即使針對(duì)含量為0.1%的樣品，其偏差也不超過(guò)國(guó)際轉(zhuǎn)基因定量方法要求的25%。就定量分析來(lái)說(shuō)，數(shù)字PCR 的定量準(zhǔn)確性及靈敏度要好于實(shí)時(shí)熒光PCR。

表2 不同含量TT51-1 大米樣品數(shù)字PCR 定量結(jié)果Table2 Quantitative results of different samples of GM rice event TT51-1 by digital PCR

2.5 方法驗(yàn)證

為驗(yàn)證本研究建立的微滴式數(shù)字PCR 定量方法的準(zhǔn)確性和精密度，在相同的測(cè)試環(huán)境和驗(yàn)證方法下，基于芯片式數(shù)字PCR 平臺(tái)，兩位試驗(yàn)人員做兩組平行試驗(yàn)，每個(gè)樣品設(shè)3 次重復(fù)，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.5%，1%，5%的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行芯片式數(shù)字PCR 定量檢測(cè)。經(jīng)優(yōu)化，Quantstudio 3D芯片式數(shù)字PCR 平臺(tái)上的內(nèi)、外源基因空白對(duì)照均未出現(xiàn)非特異信號(hào)時(shí)，所有含量的TT51-1 樣品在芯片式數(shù)字PCR 平臺(tái)上所產(chǎn)生的陰性點(diǎn)和陽(yáng)性點(diǎn)分離較好，無(wú)中間模糊區(qū)（圖5），所有重復(fù)樣品的系統(tǒng)精確性均在10%以內(nèi)（Quantstudio 3D系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算，數(shù)據(jù)未列出）。

圖5 不同含量TT51-1 樣品在芯片式數(shù)字PCR 平臺(tái)的定量結(jié)果Fig.5 Quantitative results of different contents of GM rice event TT51-1 by chip-based digital PCR

經(jīng)計(jì)算，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和5%樣品的定量結(jié)果與理論值的偏差都在5%內(nèi)，3 次重復(fù)的RSD 值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于極限值25%，表明本方法對(duì)這兩組樣品的定量精準(zhǔn)。而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和0.5%的樣品定量結(jié)果與理論值的偏差雖都大于10%，但小于極限值25%（表3），且重復(fù)性較好。本方法精準(zhǔn)定量檢測(cè)靈敏度達(dá)0.1%，定量方法精密度和準(zhǔn)確性符合要求。

表3 轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 樣品芯片式數(shù)字PCR 平臺(tái)定量結(jié)果Table3 Quantitation of TT51-1 rice by chip-based digital PCR

3 結(jié)論與討論

實(shí)時(shí)熒光PCR 在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量時(shí)是根據(jù)已知濃度轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品的含量及其擴(kuò)增Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將未知濃度的轉(zhuǎn)基因樣品擴(kuò)增結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量計(jì)算。PCR 擴(kuò)增效率、反應(yīng)抑制物及標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間的背景差異等因素都引入偏差，導(dǎo)致其定量結(jié)果往往與實(shí)際值相差較大[13，21]。而數(shù)字PCR 技術(shù)是通過(guò)絕對(duì)定量樣品中的內(nèi)參考基因和品系特異性基因的拷貝數(shù)，根據(jù)二者的比例直接計(jì)算出轉(zhuǎn)基因含量，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此比實(shí)時(shí)熒光PCR 依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定轉(zhuǎn)基因成分含量更加準(zhǔn)確。數(shù)字PCR 因采用稀釋后獨(dú)立擴(kuò)增的反應(yīng)方式，故降低了DNA 溶液中酶活抑制物的濃度，與實(shí)時(shí)熒光PCR 相比提高了低含量樣品的檢測(cè)靈敏度。此外，數(shù)字PCR 采用擴(kuò)增結(jié)束后直接計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行對(duì)靶標(biāo)基因定量，其試驗(yàn)操作的條件較為寬松。本研究采用與實(shí)時(shí)熒光PCR 同樣的引物探針和擴(kuò)增參數(shù)，最終的定量結(jié)果卻比實(shí)時(shí)熒光PCR 更加準(zhǔn)確、靈敏，也證明了這一點(diǎn)。本研究建立的數(shù)字PCR 方法在轉(zhuǎn)基因大米TT51-1 成分定量檢測(cè)中具有比實(shí)時(shí)熒光PCR 更大的應(yīng)用價(jià)值。

定量分析方法在實(shí)際檢測(cè)中進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，測(cè)量不確定度的分析具有重要的實(shí)際意義。之前的研究表明，基于實(shí)時(shí)熒光PCR 的轉(zhuǎn)基因成分定量過(guò)程中，由于內(nèi)、外源基因擴(kuò)增效率不一致帶來(lái)的不確定度以及采用低濃度標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線帶來(lái)的不確定度是測(cè)量不確定度的主要來(lái)源，其次是批內(nèi)重復(fù)的不確定度[32-33]。該方法定量的動(dòng)態(tài)范圍也受到極大地限制。而在數(shù)字PCR 中，由于無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，因此該部分不確定度可認(rèn)定為0。Bhat 等[34]認(rèn)為反應(yīng)室的容量是不確定度的主要來(lái)源，評(píng)定其相對(duì)不確定度在6%以下。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)可以用于其它數(shù)字PCR 測(cè)量的置信水平研究?？傊?，與實(shí)時(shí)熒光PCR 方法相比，影響其不確定度的主要因素已經(jīng)改變。盡可能保證抽制樣的科學(xué)性和樣品批內(nèi)的重復(fù)性，則可以減小定量的偏差和不確定度。