許春艷 孫寶國 徐友強 范光森 李秀婷*

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué) 北京100048 2 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京100048 3 北京市食品風味化學(xué)重點實驗室（北京工商大學(xué)）北京100048）

己酸乙酯是濃香型白酒的主體風味物質(zhì)，是評價白酒質(zhì)量高、低的重要指標之一[1]。白酒中的己酸乙酯在化學(xué)和酶的作用下均可以合成，主要是通過酯化酶催化己酸和乙醇合成[2-3]。酶法合成具有反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高，酶可重復(fù)利用，產(chǎn)品風味柔和，香醇自然等優(yōu)點，具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。據(jù)報道，細菌、霉菌、酵母的許多種屬均能分泌催化合成己酸乙酯的胞外酯化酶[4]。紅曲霉和根霉具有較強的己酸乙酯合成能力[5]。紅曲霉中的紫色紅曲霉和煙色紅曲霉酯化己酸和乙醇合成己酸乙酯的能力很強[6-7]，有助于縮短白酒的生產(chǎn)周期，提高優(yōu)質(zhì)品率。

紅曲霉（Monascus purpureus Went）屬于真菌界、子囊菌門、真子囊菌綱、散子囊菌目、紅曲菌科、紅曲菌屬的菌種[8]，其代謝產(chǎn)物豐富，如：紅曲色素，廣泛應(yīng)用于食品著色[9]。Monacolin K，具有降低膽固醇和降血壓的功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[10]。酯化酶，具有酯化己酸和乙醇合成己酸乙酯的能力，可催化濃香型白酒生產(chǎn)副產(chǎn)物黃水和尾酒中的酸和醇發(fā)生酯化反應(yīng)，得到己酸乙酯含量較高的香酯液，應(yīng)用于濃香型白酒調(diào)香中[6，11-14]。紅曲霉還可以產(chǎn)生具有抗氧化作用的代謝物[15]。此外，紅曲霉具有明顯的嗜酸特性，即利用乳酸為碳源代謝生長，在濃香型白酒的生產(chǎn)中具有降低乳酸和乳酸乙酯，增加己酸乙酯的作用[3，16]，是重要的濃香型白酒釀造功能微生物菌種之一。

研究發(fā)現(xiàn)，在酯化酶的作用下，己酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成己酸乙酯，是白酒中己酸乙酯合成的主要途徑[17]。由于單體調(diào)香調(diào)味物質(zhì)使用的局限性[18]，通過現(xiàn)代微生物篩選技術(shù)篩選1 株高產(chǎn)己酸乙酯酯化酶的菌株是極其必要的。有研究表明，液態(tài)酯化酶比固態(tài)酯化酶的活性穩(wěn)定，然而，目前酯化酶的液態(tài)培養(yǎng)還處于試驗階段，能夠提供生產(chǎn)用的參數(shù)少，因此優(yōu)化液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)酶條件對提高己酸乙酯產(chǎn)量具有十分重要的意義。影響菌株發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的因素分為3 個部分：培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式[19]。

本試驗對1 株合成己酸乙酯性能最高的菌株YJX-8 進行鑒定。利用液態(tài)培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)酯化酶，對紅曲霉產(chǎn)酯化酶工藝條件進行全面優(yōu)化[20]，確定最佳工藝條件，以期為己酸乙酯酯化酶的生產(chǎn)合成提供理論依據(jù)。最后研究酯化酶對乙酸、丁酸、己酸和乳酸的催化生成能力，為后續(xù)酯化酶酯化特性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

菌 株：紅 曲 霉ZSM-9-2、F7302、F7304、F8404、YJX-8、YJX-9-1、YJX-9-3、YJX-12、YJX-13-4、JT-9、JT-10，實驗室分離自濃香型酒曲。

試劑：真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒，OMEGA 公司；ExTaq 酶，NEB 公司；引物的合成，北京奧克鼎盛生物科技有限公司；序列的測定，華大基因。

乙酸、正己酸、丁酸、乳酸、無水乙醇、正己烷均為國產(chǎn)分析純級；己酸乙酯（99%），源葉生物。

培養(yǎng)基：

①斜面培養(yǎng)基 【馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基】 將去皮馬鈴薯200 g 切成小塊，加1 000 mL 水，煮30 min，雙層紗布過濾，濾液中加入20 g 葡萄糖，蒸餾水補充至1 L，pH 值自然，在固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

②察氏培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖30、NaNO33、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO40.01、瓊脂20，pH 值自然，121 ℃、30 min。

③發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）[21]可溶性淀粉70、黃豆餅粉10、酵母浸膏10、MgSO41、NaNO32、NaH2PO41，pH 4.5，121 ℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B 型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀，美國安捷倫科技公司；T100-Thermal cycler 聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，美國Bio-Rad 公司；EPS301 瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；ImageQuant 300 凝膠成像儀，美國GE 公司；HD-1360 潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；LHS-150HC-I恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；IS-RDD3 溫振蕩器，北京科創(chuàng)百方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 根據(jù)參考文獻[22]～[24]，采用氣相色譜-外標法檢測乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯的含量。氣相色譜條件：色譜柱：DB-Wax 毛細管色譜柱（30 m × 0.32 mm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），載氣為高純氮氣；進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度220 ℃，分流比5 ∶1，進樣量1 μL；柱溫：升溫程序：60 ℃保持3 min，以3.5 ℃/min 升至180 ℃，保持10 min；各氣體流速：載氣（N2）：1 mL/min；H2：30 mL/min；空氣：400 mL/min；尾吹氣：25 mL/min。

1.3.2 紅曲霉合成己酸乙酯性能的比較 對實驗室已有編號為ZSM-9-2、F7302、F7303、F7304、YJX-8、YJX-9-1、YJX-9-3、YJX-12、YJX-13-1、JT-7、JT-9、JT-10 的12 株紅曲霉菌株的己酸乙酯合成性能進行比較，己酸乙酯產(chǎn)量采用1.3.1 節(jié)方法檢測。通過比較，篩選1 株己酸乙酯合成性能較強的菌株做后續(xù)試驗。

1.3.3 YJX-8 菌株鑒定

1.3.3.1 菌株形態(tài)觀察 在PDA、察氏固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察其外部形態(tài)。采用粘片法，顯微鏡下觀察菌絲體形狀、大小，孢子大小、形狀、類型、顏色。

1.3.3.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 按照真菌DNA提取試劑盒提取紅曲霉YJX-8 的基因組，采用rDNA 基因序列分析，以提取的真菌的總DNA 為模板，采用ITS 通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCT-3′；ITS4：5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）和β-微管蛋白引物（βt2a：5′-GGTAAC CAAATCGGTGCTGCTTTC-3′；βt2b：5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′），通過PCR 擴增其ITS 和beta tubulin 序列。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物送被至北京華大基因測序有限公司測序。將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中核酸序列進行比對，選取同源性高的菌株的ITS r DNA 序列和模式菌株的β-微管蛋白序列，利用MEGA 6.0 軟件進行多序列比對，用鄰接（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 粗酶液的制備 將紅曲霉采用點種法接種于PDA 平板上，培養(yǎng)5 d。

搖瓶培養(yǎng)：采用刮刀切1 塊1 cm2菌塊接種于裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)5 d。

用4 層紗布過濾分離菌絲體和發(fā)酵液，將濾液在4 ℃、3 500 r/min 條件下離心15 min，除去沉淀，上清液于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 發(fā)酵液酶活力的測定 制備酯化液[25-26]：取100 mL 具塞玻璃三角瓶，依次添加粗酶液0.5 mL、pH 6.0、0.2 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液、無水乙醇1 mL、正己酸0.05 mL，混勻。30 ℃、180 r/min 恒溫振蕩酯化24 h。以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基取代粗酶液作為空白對照。

樣品處理：取2 mL 酯化液，加入等體積的正己烷，于漩渦混勻器上萃取30 s，靜置，取上層萃取液過濾，用氣相色譜檢測[13]。

酶活力單位定義（U/mL）[27-28]：以酯化液中1 h合成1 μmol 己酸乙酯所需要的酶量定義為1 個酶活力單位。

1.3.6 紅曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化 將紅曲霉YJX-8 接種于PDA 平板上，在30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，然后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。依次考察碳源種類（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖）、碳源質(zhì)量濃度（50，60，70，80，90，100，110 g/L）、氮源種類（黃豆餅粉、酵母浸膏、牛肉膏、胰蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨）、氮源質(zhì)量濃度（10，15，20，25，30，35，40 g/L）對產(chǎn)酶的影響。檢測方法參照1.3.1 節(jié)。

1.3.7 紅曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化 將紅曲霉YJX-8 接種于PDA 平板上，在30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，然后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d。依次考察初始pH 值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）、溫 度（24，27，30，33，36，39，42 ℃）、轉(zhuǎn) 速（120，140，160，180，200，220 r/min）對產(chǎn)酶的影響。檢測方法參照1.3.1 節(jié)。

1.3.8 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果及發(fā)酵過程中的實際情況，擬定不同因素水平?？疾禳S豆餅濃度、初始pH 值、轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響，尋找紅曲霉發(fā)酵條件的最佳組合。利用最優(yōu)組合做驗證試驗。

1.3.9 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響 利用最優(yōu)組合做發(fā)酵時間試驗，考察發(fā)酵時間（0，1，2，3，4，5，6，7 d）對產(chǎn)酶的影響。

1.3.10 酯化酶底物特異性研究

1.3.10.1 酯化酶對單一酸的催化能力 取100 mL 具塞玻璃三角瓶，依次添加3.45 mL 磷酸鈉緩沖液、0.5 mL 粗酶液、1 mL 無水乙醇，分別添加50 μL 乙酸、丁酸、正己酸、乳酸，混勻。30 ℃、180 r/min 恒溫振蕩酯化24 h。以高溫滅活的粗酶液作為空白對照，考察酯化酶對四大酸的選擇性。1.3.10.2 酯化酶對混合酸的催化能力 取100 mL 具塞玻璃三角瓶，依次添加3.45 mL 磷酸鈉緩沖液、0.5 mL 粗酶液、1 mL 無水乙醇、四大酸（乙酸、正己酸、丁酸、乳酸）各12.5 μL，混勻。30 ℃、180 r/min 恒溫振蕩酯化24 h。以高溫滅活的粗酶液作為空白對照，考察酯化酶對四大酸的選擇性。

2 結(jié)果與分析

2.1 己酸乙酯合成性能比較

由圖1看出，通過對12 株紅曲霉合成己酸乙酯的性能的比較，得出菌株YJX-8 合成己酸乙酯性能最好，己酸乙酯產(chǎn)量最高。選擇該菌株為后續(xù)試驗的對象。

圖1 紅曲霉己酸乙酯合成性能比較Fig.1 Comparison of the performance of synthesized ethyl hexanoate

2.2 菌種鑒定結(jié)果

2.2.1 菌落形態(tài) 菌株YJX-8 在兩種平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 的菌落形態(tài)見表1。

菌落形態(tài)特征分析：菌株YJX-8 在PDA 培養(yǎng)基上的生長速度明顯優(yōu)于察氏培養(yǎng)基（見圖2），培養(yǎng)初期均為白色小菌落，時間久后顏色變深，菌落呈絨氈狀。

表1 菌株YJX-8 的菌落形態(tài)Table1 Colonial morphology of strain YJX-8

圖2 菌株YJX-8 在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of strain YJX-8 on the medium

2.2.2 個體形態(tài) 在顯微鏡下觀察菌株YJX-8的個體形態(tài)（見圖3），可以看出菌株有閉囊殼，分生孢子，細胞橫隔，分杈菌絲。

根據(jù)菌株YJX-8 的個體形態(tài)特征、菌落形態(tài)特征鑒定，比對《菌種保藏手冊》，確定該菌株各項特征與曲霉科紅曲霉屬的特征基本一致，初步判斷該菌株可能屬于紅曲霉屬（Monascus）。

2.2.3 分子生物學(xué) 為了進一步確定該菌的分類地位，在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上進行分子生物學(xué)鑒定。采用真菌基因組提取試劑盒提取菌株的總DNA（見圖4a），擴增并進行ITS 和β-微管蛋白功能區(qū)序列測定。當PCR 擴增得到長度為557 bp的ITS 序列和514 bp 的β-微管蛋白功能區(qū)序列（見圖4b），將測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 進行比對，選取同源性較高的模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析（見圖5）。

圖3 菌株YJX-8 的個體形態(tài)Fig.3 Individual forms of strain YJX-8

圖4 菌株YJX-8 的基因組（a）以及rDNA PCR 擴增產(chǎn)物（b）電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis analysis of genome（a）and rDNA PCR products（b）of strain YJX-8

由圖5可以看出，菌株YJX-8 與紫色紅曲霉聚于一支，相似度達到99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，將紅曲霉YJX-8 初步鑒定為1 株紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 碳源對產(chǎn)酶的影響 由圖6a 可以看出，相比于無碳源添加的培養(yǎng)基，碳源有利于紅曲霉YJX-8 產(chǎn)酯化酶，且蔗糖為碳源時酯化酶的酶活最高，達（0.515±0.083）U/mL，較可溶性淀粉為碳源時，酶活提高2 倍。其次是麥芽糖，可溶性淀粉、葡萄糖和乳糖作為碳源，YJX-8 所產(chǎn)酯化酶的酶活無顯著性差異，乳糖為碳源的最低。任佳明等[2]研究發(fā)現(xiàn)紫色紅曲霉在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)酯化酶的酶活力最高。潘名志等[29]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和可溶性淀粉作為紅色紅曲霉液態(tài)發(fā)酵碳源產(chǎn)酯化酶的能力相當，說明不同來源紅曲霉的最佳碳源種類不同。

2.3.2 蔗糖含量對產(chǎn)酶的影響 由圖6b 可以看出，酯化酶酶活隨著蔗糖添加量的升高呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，分析原因可能是碳源濃度過低不利于微生物的生長，碳源濃度過高，會導(dǎo)致不適的碳氮比，不利于菌體生長和產(chǎn)酶。蔗糖添加量為90 g/L 時，酯化酶酶活最高為（0.822±0.043）U/mL，較上一步酶活提高1.6 倍。

2.3.3 氮源對產(chǎn)酶的影響 由圖6c 可以看出，菌株YJX-8 在無氮源添加的培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)酯化酶，說明氮源是菌株YJX-8 產(chǎn)酯化酶的必要物質(zhì)。黃豆餅粉作為氮源，酯化酶酶活遠遠高于其它氮源，其次是牛肉膏、酵母膏、蛋白胨。文獻[30]也報道，根霉屬H-3 的最適產(chǎn)酶氮源為黃豆餅粉。分析原因可能是黃豆粉與其它氮源比較，黃豆餅粉中的油對紅曲霉分泌酯化酶有誘導(dǎo)作用。復(fù)合氮源和黃豆粉作為氮源時，YJX-8 所產(chǎn)酯化酶的酶活無顯著性差異?？紤]到黃豆餅粉較復(fù)合氮源簡單、廉價，最終選擇黃豆粉作為氮源。

2.3.4 黃豆餅粉含量對產(chǎn)酶的影響 由圖6d 可以看出，酯化酶的酶活隨著黃豆餅粉濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，分析原因可能是低于或高于最適碳氮比，不利于產(chǎn)酶。黃豆餅粉質(zhì)量濃度為25 g/L 時酯化酶酶活最高，酶活為（1.103 ±0.034）U/mL，較上一步提高1.4 倍。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 初始pH 值對產(chǎn)酶的影響 文獻[21]報道，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值影響微生物的生長繁殖和產(chǎn)物的合成，不同的微生物對pH 值的要求各不相同，微生物只在一定的pH 范圍內(nèi)生長，并使代謝物產(chǎn)量達到最大。潘志明等[29]研究發(fā)現(xiàn)，紅色紅曲霉（Monascus ruber）ZK 產(chǎn)酯化酶的最優(yōu)培養(yǎng)基初始pH 值為5.5。李付麗等[21]研究了1 株產(chǎn)酯能力較高的紅曲霉菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值為4.5。王曉丹等[4]研究了紅曲霉產(chǎn)己酸乙酯脂肪酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH 7，說明不同紅曲霉產(chǎn)酯化酶的最適培養(yǎng)基初始pH 值不同。由圖7a 可以看出，紅曲霉YJX-8 所產(chǎn)酯化酶的酶活隨著培養(yǎng)基初始pH 值的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當培養(yǎng)基初始pH 4.5 時，有利于菌體產(chǎn)酶，酯化酶的酶活為（1.050±0.107）U/mL。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度影響紅曲霉的生長和酯化酶的分泌量，紅曲霉一般適應(yīng)溫度范圍為15～42℃，最適宜溫度范圍為28～35℃[31]。考慮到紅曲霉的生長溫度范圍，選擇溫度范圍24～42 ℃考察培養(yǎng)溫度對紅曲霉YJX-8 產(chǎn)酶的影響。由圖7b 可以看出，酯化酶的酶活隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當溫度為30 ℃時，產(chǎn)酶量最高，酶活為（0.920±0.056）U/mL。當培養(yǎng)溫度較低時，菌絲體生長緩慢，產(chǎn)酶量少，溫度過高，酯化酶酶活明顯降低，分析原因可能是較高或較低溫度不僅影響菌株的生長，而且影響酯化酶的分泌[4]。

2.4.3 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響 由圖7c 可以看出，轉(zhuǎn)速為180 r/min 時酯化酶的酶活較高，達（0.967±0.010）U/mL。文獻[25]報道，轉(zhuǎn)速不僅影響氧的轉(zhuǎn)移速率，而且決定培養(yǎng)液中菌絲球所受機械力的大小。適當?shù)霓D(zhuǎn)速可以提高氧的轉(zhuǎn)移率，促進菌絲的生長，使菌絲體受到適當?shù)募羟辛?，菌絲間纏繞不緊密，菌絲球松散，利于通氣。

2.5 正交試驗結(jié)果

通過SPSS 軟件對單因素試驗結(jié)果進行分析，選取對紅曲霉產(chǎn)酯化酶影響顯著的因素做正交試驗，對其結(jié)果進行極差分析，確定最佳的產(chǎn)酯化酶培養(yǎng)條件。采用L9（33）正交表，以培養(yǎng)基中黃豆餅粉含量（A）、初始pH 值（B）、轉(zhuǎn)速（C）作為3 個考察因素，選取3 個水平做試驗。

按表2的正交因素水平設(shè)計【L9（33）】正交試驗，結(jié)果見表3。

表2 正交因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal tests

表3 L9（33）正交設(shè)計及結(jié)果Table3 Design and results of L9（33）orthogonal tests

（續(xù)表3）

由表3的極差分析結(jié)果可以看出，RB＞RA＞RC，3 個因素對紅曲霉產(chǎn)酶的影響依次為：初始pH 值（B）＞黃豆餅粉濃度（A）＞轉(zhuǎn)速（C），3 個因素的影響較為顯著。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到紅曲霉產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C2，即黃豆餅粉質(zhì)量濃度25 g/L、初始pH 值4.5、轉(zhuǎn)速180 r/min，與單因素試驗結(jié)果一致。

2.6 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

由圖8可以看出，紅曲霉培養(yǎng)2 d，幾乎無酶活，是因為紅曲霉在這段時間主要用于菌體的生長，不產(chǎn)酯化酶。培養(yǎng)2 d 后，開始產(chǎn)酯化酶，酶活較低，這是因為紅曲霉生長速度慢，產(chǎn)酶量少。培養(yǎng)3 d 后，酶活快速上升，且酯化酶的酶活隨著發(fā)酵時間的延長而升高。發(fā)酵6 d 后，酯化酶的酶活呈平穩(wěn)趨勢，原因可能為隨著發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌體衰老甚至自溶，進而影響產(chǎn)酶。由于發(fā)酵第6 天和第7 天，酯化酶的酶活無顯著性的差異，因此6 d 為較佳培養(yǎng)時間。

2.7 底物特異性

2.7.1 酯化酶對單一酸的催化能力 紅曲霉酯化酶對單一酸乙酸、丁酸、己酸和乳酸的酯化作用結(jié)果見表4。紅曲霉酯化酶對己酸與乙醇的酯化有很強的促進作用，生成己酸乙酯的量最多，（42.07±0.87）mg/100 mL，其次是乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯產(chǎn)量低，說明該紅曲霉酯化酶是一類專一性較強的酶。

圖8 發(fā)酵時間對菌株YJX-8 產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of fermentation time on enzyme production from strain YJX-8

2.7.2 酯化酶對混合酸的催化能力 由表5可以看出，在等量混合酸中，乙醇與四大混合酸在酯化酶的作用下主要生成己酸乙酯，產(chǎn)量為（32.68 ±0.78）mg/100 mL。生成少量的丁酸乙酯、乳酸乙酯，無乙酸乙酯生成，說明紅曲霉酯化酶對己酸的選擇性最好，與任道群等[32]研究結(jié)果一致。其研究表明紅曲霉能夠促進己酸、丁酸及混合酸和乙醇的酯化作用，生成的酯類物質(zhì)均為己酸乙酯，且酯化力極強。截止目前，已有水相中酯化酶對底物酸特異性的相關(guān)研究。如杜禮泉等[25]研究了紅曲霉酯化酶的專一性，該酯化酶對乙酸、丁酸和己酸有較強的酯化作用，能夠形成相應(yīng)的酯類，然而酯化酶專一性低，屬于鍵專一性酶。唐玉明等[28]研究了叢毛紅曲霉所產(chǎn)酯化酶的特性，該酯化酶能夠催化單一酸乙酸、己酸、乳酸形成相應(yīng)的酯類，催化丁酸和混合酸形成己酸乙酯。徐前景等[33]研究了煙灰色紅曲霉粗酶制劑的酯化特性，該酯化紅曲對己酸乙酯具有很強的催化專一性。說明不同種來源紅曲霉酯化酶底物特異性不同。

表4 酯化酶對單一酸和乙醇的酯化Table4 Esterification of single acid and ethanol by enzymes

表5 酯化酶對混合酸和乙醇的酯化Table5 Esterification of mixed acids and ethanol by enzymes

3 結(jié)論

從12 株紅曲霉中篩選到1 株合成己酸乙酯性能較高的紅曲霉YJX-8，通過菌落形態(tài)、個體形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定為1 株紫色紅曲霉。通過單因素和正交法優(yōu)化，最終確定該紫色紅曲霉發(fā)酵液最佳產(chǎn)酶條件：蔗糖90 g/L、黃豆餅粉25 g/L、MgSO41 g/L、NaH2PO41 g/L、pH 4.5、30 ℃、180 r/min、6 d。在該條件下，酯化酶的酶活達（1.177 ±0.009）U/mL，較優(yōu)化前酶活提高4.56 倍。

通過對YJX-8 菌株所產(chǎn)酯化酶底物特異性的研究，得出紅曲霉YJX-8 酯化酶是對己酸乙酯的生成有較強促進作用的酶，可緩解濃香型酒中己酸乙酯含量不足的問題。優(yōu)化提高該紅曲霉酯化酶合成己酸乙酯的能力，具有十分重要的意義。

本研究為紅曲霉酯化酶液態(tài)生產(chǎn)提供工藝參數(shù)。對該酯化酶中起作用的酯化酶基因還有待研究。